生物分离工程电泳1.pptVIP

Electrophoresis 电泳在生化分离中的应用 分离和纯化手段（实验室） 蛋白、酶、核酸纯化 基础理论研究 醋酸纤维薄膜电泳分析血清蛋白 琼脂对流免疫电泳分析病人血清，早期诊断肝癌 高压电泳分离肽段，研究蛋白质一级结构； 凝胶电泳技术分离分析酶，蛋白质，核酸 电泳原理 指带电粒子在电场中朝与自身带相反电荷的电极移动的现象 带电颗粒 小离子：Cl-, 甘氨酸离子 生物大分子：蛋白质、核酸等 蛋白质分子是由氨基酸组成的，而氨基酸带有可解离的氨基和羧基，是典型的两性电解质，在一定的pH条件下就会解离而带电 电泳速度 v = EZe/(6пrη) 影响泳动速度的因素-1 带电颗粒的性质 所带净电荷的数量 颗粒大小 形状 影响泳动速度的因素-2 粒子的pI和溶液pH值 影响泳动速度的因素-3 外加电流电压 U ?，E ?，v ? (1) 常压电泳: U=100~500V，E=2~10V/cm t=几小时至数天 适合于分离蛋白质等大分子物质 (2) 高压电泳：U=500~1000V，E=50~200V/cm t=几分钟 分离氨基酸，肽，核苷酸，糖类等小分子物质 由于电压升高，电流也随之增大，故需冷却装置 影响泳动速度的因素-4 溶液的离子强度 I = (∑cizi2 )/2 — 保持足够缓冲能力前提下，离子强度要最小 — 溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越 慢，反之越快 — 最适离子强度0.02 – 0.2 影响泳动速度的因素-5 电渗作用 在电场中液体对固体支持物的相对移动 影响泳动速度的因素-6 对支持物的选择 支持物均匀，吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离 琼脂糖和淀粉在电场作用下易电离带负电荷，产生电渗流，应用范围受限制。聚丙烯酰胺凝胶常用。 凝胶电泳 SDS Gel Elecrtophoresis SDS测定蛋白质相对分子量 PAGE凝胶电泳分离、检测蛋白质 SDS测定蛋白质相对分子量 SDS：阴离子去污剂、水溶液中以单体和分子团存在。 SDS测定蛋白质相对分子量 操作： 样品分子量的确定 M为蛋白质分子量、m相对迁移率、b为斜率、K为截距。 一定条件下K和b为常数，根据迁移率可求得分子量。 样品分子量的确定 * CATHODE ANODE + - - + 用支持体的电泳技术 1. 滤纸电泳 2.醋酸纤维薄膜电泳 3.薄层电泳 4.非凝胶性支持体区带电泳 ( 淀粉，纤维素粉，玻璃粉，硅胶等 ) 5.凝胶支持体区带电泳 ( 聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶 ) 不用支持体的电泳技术 Tiselius或微量电泳 操作形式： 1. 区带电泳 2.等速电泳 3.等电点电泳 电泳形式分类 + - - Z，r E f’ f E: 电场强度,V/cm Z: 溶质的荷电荷数 η：溶液粘度 e: 1.6?10-19C 1. 粒子在电场中所受的力: f = EZe 2. 粒子在液体中泳动所受的阻力： 根据Stoke定律 f′= 6пrηv 平衡时：f = f ’ 恒定泳动速度: 溶质的迁移率： u0= v/E=Ze/(6пrη) 区带电泳 影响泳动速度的因素 Friction Charge 外加电流电压 分子量分子形状 分子的等电点 Voltage + - - + v=EZe/(6пrη) 恒定泳动速度: 7.1 5.1 5.06 4.0 pI γ球蛋白 β球蛋白 α2球蛋白 白蛋白 protein 白蛋白 α2球蛋白 β球蛋白 γ球蛋白 血清中的四种蛋白 pH8.6的电泳缓冲液中电泳，泳动速度： v=EZe/(6пrη) 恒定泳动速度: 滤纸电泳 Cellulose pH=8.6 电泳血清蛋白 + - γ球蛋白 - 滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷 与带电颗粒一样可以吸引正离子 介质向阴极移动 γ球蛋白: 颗粒大，净电荷少 电渗作用—石英毛细管电泳 Capillary Electrophoresis pH3 内表面带负电 毛细管管壁分布有大量的硅烷醇（Si-OH） 阳离子被吸附在管壁而形成了双电层 V= V(电渗流)＋V(电泳) V (正) V (中)V (负) Example 1 计划在0.82v/cm的电位梯度下，用凝胶电泳的方