DNA多态性分型技术2013..演示教学.pptVIP

第三节 DNA多态性分型技术;什么是DNA多态性?;DNA多态性对微生物有哪些实际意义？ ;在疾病预防控制中的应用;DNA多态性分析常用的方法;一、限制性片段长度多态性分析 restriction fragment length polymorphism，RFLP ;每种生物基因型具有其独特的特征，及独特的限制酶识别序列分布，其基因组DNA在限制性内切酶作用下，产生相当多的大小不等片段，这些片段经电泳以后几乎是连续排列的，如用放射性同位素标记的DNA作探针，将与被标记的DNA相关的片段检测出来，即可构建出多态性图谱。;因此，RFLP即是基于限制性核酸内切酶酶切消化核酸及标记的DNA探针能与任何序列相似的片段杂交，通过片段长度变异性来检测生物体多态性。;基本方法 ;限制性内切酶 (restriction endonuclease， RE） 一类能识别环状或线性双链DNA特定核苷酸序列的DNA水解酶，在合适反应条件下，使每条链的一个磷酸二酯键断开，产生多种可测量的寡核苷酸片段的酶。 ;内切酶的命名规则 前三个字母代表其来源的细菌种名，用斜体字母，第四个字母代表菌株名称，如果同一株菌有不同限制性内切酶系统，则不同的内切酶系用罗马数字区分。 例：EcoRI代表该酶来源于E. coli的R菌株。 ;琼脂糖凝胶电泳槽和电泳仪;转移电泳槽;;核酸分子杂交的概念及原理; 核酸经加热变性后，在低于变性温度20℃~ 30℃时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。 ;根据探针上的标记，可用放射自显影或加入酶底物显色的方式观察结果。;优点 1．可靠性较高 2．来源于自然变异 3．标记覆盖面广 ;缺点：;讨论： RFLP与脉冲场凝胶电泳都是根据基因组上的限制性内切酶位点的多态性来对生物进行基因分型的，那么它们两者的异同点有哪些呢？;基于上述RFLP的缺点，一种更好的分析技术——聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析技术 （PCR-RFLP ）应运而生。;结合PCR技术与RFLP技术的优点，其基本原理是对目的基因片段PCR扩增后，利用多种限制性内切酶，对扩增产物进行酶切，不同基因序列，不同限制性内切酶酶切扩增产物，在电泳后可产生不同电泳图谱，通过对电泳图谱的分析，得出基因多态性结果。 思考：需要和探针做核酸杂交吗？为什么？;1. 提取DNA 2. 设计特异引物进行目的基因PCR反应 3. 将DNA扩增产物选用合适限制性内切酶酶切 4. 将酶切出来的具各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离 5. 对显示出来的带谱进行分析。 ;优 缺 点 ;RFLP与PCR-RFLP的应用;二、随机扩增多态性DNA分析技术 random Amplified Polymorphism DNA， RAPD ;模板DNA经92～94℃变性解链后，在较低温度下退火，此时，有许多位点能与随机合成的短引物互补而形成双链结构。如果某两位点间在可扩增范围之内，且分别位于互补的两条单链上，并且与引物的3’端相对应，就可以通过PCR得到一个扩增产物。;RAPD所用的一系列DNA引物序列各不相同，但对于任意特定引物，它同基因组DNA序列有其特定结合位点，如果基因组在这些区域发生片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应变化，而使PCR产物增加、减少或发生分子量改变，产生多态性图谱。;总DNA提取;①采用随机引物，无需预先知道被研究生物基因组核苷酸序列； ②引物短，在整个基因组内的结合位点多，2种甚至多种引物可混用； ③成本较低； ④操作简便，快速； ⑤DNA分析效率较高； ⑥所需DNA样品少。;①重复性不高（最大缺点）； ②只能区分不同大小的片段，而不能区分有不同碱基序列但大小相同片段； ③需对引物进行筛选，难以进行标准化。;三、细菌基因组重复 序列PCR技术 （repetitive-element PCR, rep-PCR） ——一种基于PCR的DNA标记技术; rep-PCR技术是利用基因组中广泛分布的短重复序列（repetitive sequences)为引物进行PCR扩增，通过对PCR产物的电泳结果进行比较，来分析菌株间基因组存在的差异。; 目前研究最多、最常用的细菌基因组短重复序列有：; 两者的共同特征是它们在细菌基因组中存在着菌株、种、属水平上的分布和拷贝数量的差异，而序列本身在进化过程中又具有较强的保守性。;两种短重复序列的特点及功能：; REP家族序列广泛分布在大肠埃希菌和沙门菌基因组内(提示什么？）。REP序列可以单独出现或增加为4个串联的重复单位。在E.coli的染色体上，存在500到