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第六章 DNA体外重组操作 ;;第一节 重组体导入受体细胞的原理与技术;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;自然界中不是所有细菌都能够吸收DNA, 进行自然转化，也不是生长的任何阶段都具有吸收DNA的能力。 细菌的感受态是可以诱导的，而且此时,细菌摄取DNA是非选择性，并可以用异源启动子启动转录和蛋白质合成。 因此，采取一些方法(电击法、CaCl2、RbCl/KCl等化学试剂法)处理细胞, 使细胞膜的通透性发生暂时性的改变,容易接受外界DNA, 这类细胞被称为感受态细胞(competent cells)。 ;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;关键点(1)使用对数生长期的细菌； (2)低温操作。 优点: 简单、稳定、可重复性高。 缺点: 转化效率稍低，每微克DNA产生106-107转化子；不能转化大质粒载体(＞15Kb)。 ;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;一、重组DNA导入大肠杆菌的方法;二、外源目的基因导入真核细胞;二、外源目的基因导入真核细胞;二、外源目的基因导入真核细胞;二、外源目的基因导入真核细胞;二、外源目的基因导入真核细胞;基因枪法：利用火药爆炸、高压放电或高压气体作为驱动力加速金属粒子(微弹)，使其进入带壁细胞的一种方法。 质粒DNA首先沉淀在微弹(钨粉、金粉等)表面(通常以氯化钙、亚精胺作为沉淀剂来促进DNA与微弹的结合)，结合有DNA分子的微弹经加速而获得足够动量，进而穿透植物细胞壁进入靶细胞，随后释放出DNA分子并随机整合到寄主的基因组内。 根据动力来源的不同，基因枪大体可以分为火药式、放电式和气动式三种类型。 ;二、外源目的基因导入真核细胞;二、外源目的基因导入真核细胞;第二节转化子的筛选与重组子鉴定;;转化子的筛选与重组子的鉴定方法;;一、遗传学检测法;一、遗传学检测法;一、遗传学检测法;一、遗传学检测法;一、遗传学检测法;(一)载体表型选择法 　1.抗药性标记及其插入失活选择法 pBR322 选择过程 　　（2）氨苄青霉素抗性插入失???选择过程 　　　如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。 ;(一)载体表型选择法 　2. ?-半乳糖苷酶显色反应选择法;一、遗传学检测法;一、遗传学检测法;　(二)根据插入基因的遗传性状的选择 　　　利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）。 　　1.原理 　　（1）弥补缺陷 　　　转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 ;　(二)根据插入基因的遗传性状的选择 　　1.原理 　（2）增加新性状 　　　使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 　　 例：小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。 ;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;二、核酸分子杂交检测法;三、物理检测法;三、物理检测法;三、物理检测法;三、物理检测法;四、免疫化学检测法;四、免疫化学检测法;四、免疫化学检测法;四、免疫化学检测法;四、免疫化学检测法;四、免疫化学检测法;四、免疫化学检测法;四、免疫化学检测法;　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（1）固定样品 　　　将待测样品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底。 ;　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　（2）一抗结合;　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（3）二抗结合 　　　加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉。二抗只识别一抗。 ;　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（4）显色反应 　　　加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）。;四、免疫化学检测法;　(三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　2. ELISA检测的一般步骤 　　（5）比色 　　在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。 ; (三)酶联免疫吸附测定（ELISA） 　　3. ELISA的局限性 　　　有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）。 　　　必须与其他方法一起综合考虑。 ;　(四)免疫印迹（w