细胞培养工程 05 细胞培养生物反应器(I).ppt

生物反应器 – 过程参数检测与控制 DO 甘汞电极 受溶液（化学成分）环境干扰比较大 输出信号：电压 极谱氧电极 电极不与培养基液体直接接触，由一层膜隔离 氧分子跨膜扩散速率与DO 浓度成正比 输出信号：电流 耐高温灭菌 性能稳定 * pH电极 耐高温灭菌 性能稳定 温度电极 热电偶 性能稳定 细胞培养工程 南开大学 生物反应器 – 过程参数检测与控制 生物反应器控制的重要性 为细胞生长提供一个稳定的生理环境 DO、pH、温度在线自动控制相对比较容易实现 主要底物和代谢副产物通常在无菌取样后分析 葡萄糖 葡萄糖氧化酶 乳酸 乳酸脱氢酶 谷氨酰胺 谷氨酸脱氢酶/心肌磺酶/天冬酰胺酶 铵离子 谷氨酸脱氢酶 氨基酸 HPLC 现已有多种酶电极分析装置，可以提供在线检测，并可以根据设定值添加以维持某种底物的浓度恒定，但购置与使用成本很高。 * 细胞培养工程 南开大学 支原体（Mycoplasma） /read.php?tid=164679 支原体，又称霉形体，1898 年发现，为目前发现的最小、最简单的原核生物，大小介于细菌和病毒之间。 支原体细胞中唯一可见的细胞器是核糖体。没有细胞壁，多数成球形，具有较大的可变性。 支原体可以在特殊的培养基上接种生长，进行临床鉴定。 形态 大小为 0.2 - 0.3 μm，无细胞壁，形态呈现多形性，可通过滤膜； Giemsa 染色法呈淡紫色（革兰氏染色不易着色）； 细胞膜胆固醇含量丰富，约占 36%。 基因组 一个环状双链 DNA，分子量小（仅有大肠杆菌的1/5），合成与代谢能力很有限。 生长特性 繁殖方式多样，二分裂繁殖为主，还有断裂、分枝、出芽等方式； 支原体细胞分裂与其 DNA 复制不同步，可形成多核长丝体； 体外培养需 10 - 20% 人或动物血清（胆固醇）； 最适 pH 7.8 - 8.0 ，一般低于 7.0 则死亡（解脲脲原体，pH 6.0 - 6.5）； 大多数兼性厌氧，生长缓慢，在琼脂含量较少的固体培养基上孵育 2 - 3 天出现典型的 “荷包蛋样” 菌落（圆形，直径 10 - 16 μm），核心部分较厚，向下长入培养基，周边为一层薄的透明颗粒区； 支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜或培养细胞中生长； 生化反应分型 一般能分解葡萄糖的支原体不能利用精氨酸，能利用精氨酸的则不能分解葡萄糖，据此可将支原体分为两类； 解脲脲原体不能利用葡萄糖或精氨酸，但可利用尿素作能源。 表面抗原 各种支原体都具有型特异性，少有交叉反应。 抵抗力 支原体对热的抵抗力与细菌相似； 对环境渗透压敏感，渗透压的突变可致细胞破裂； 对重金属盐、石炭酸、来苏尔和一些表面活性剂较细菌敏感，但对醋酸铊、结晶紫和亚锑酸盐的抵抗力比细菌大； 对影响壁合成的抗生素如青霉素不敏感，但作用于核糖体的抗生素（红霉素、四环素、卡那霉素、链霉素及氯霉素等）可抑制或影响蛋白质合成，对支原体有抑制作用，但不能根治，易反复。 抗原性与致病性 支原体不侵入机体组织与血液，不能使机体对其产生免疫抗体； 支原体感染呼吸道、泌尿或生殖道上皮细胞后，通过不同机制引起细胞损伤，如获取细胞膜上的脂质与胆固醇造成膜的损伤，释放神经（外）毒素、磷酸酶及 H2O2 等； 动物细胞培养生物反应器 * 细胞培养工程 南开大学 1. 生物反应器概述 * 细胞培养工程 南开大学 细胞培养生物反应器 基因工程技术出现之前 低血清贴壁培养动物细胞，用于病毒疫苗生产 细胞培养工程 南开大学 微生物发酵简史 1920s：酒精、甘油和丙酮等（厌氧发酵） 1940s：青霉素/抗生素、有机酸、微生素、激素等 （无菌技术与深层发酵 - 通气/搅拌) 1950s：谷氨酸/氨基酸、核苷酸、有机酸和部分抗生素 （代谢控制与菌种人工诱变） 1970s：定向育种、基因工程蛋白质表达 * 细胞培养工程 南开大学 Molecular Cell Biology (5th ed.) by Lodish et al. 微生物与动物细胞的主要差异 尺度 细胞壁 生长速度 细胞培养工程 南开大学 * 微生物与动物细胞的主要差异 微生物细胞 尺度小，有细胞壁，抗剪切力能力较强 生长速度快，溶解氧（DO）需求较高 通气量：较高甚至很高 搅拌：能量输入较高，主体混合与微混合（搅拌桨） 动物细胞 尺度大，无细胞壁，抗剪切力能力较差 生长速度慢，溶解氧（DO）需求较低 通气量：较低 搅拌：能量输入较低，主体混合（搅拌桨） * 细胞培养工程 南开大学 细胞培养生物反应器：1980-90s（1） 微生物深层发酵技术已经相当成熟 搅拌式生物反应器设计和性能 控制与配套设施 细胞培养从有血清贴壁到无血清悬浮的过渡 能否悬浮生长（杂交瘤细胞例外） 能否无血清生长 能否耐受反应器内搅拌剪切力 能否耐受通氧（气泡