第五章PCR实验中的样本制备.pptVIP

其它标本 尿液 前列腺液 尿道口分泌物 阴道分泌物 宫颈口粘液 咽喉拭子、鼻腔分泌物 粪便 TE缓冲液 10mmol/L Tris-Cl, 1mmol/L EDTA,pH7.5或8.0。 如MagNA pure LC全自动核酸提取仪，采用的吸附颗粒为表面包有一层硅的磁性微颗粒。全自动核酸提取仪器的应用，不但降低了核酸提取的劳动强度，而且减少了核酸的手工提取中容易出现的操作失误，增加核酸提取的一致性和重复性。 2）操作步骤 200μl血清（浆）加入200μl6M异硫氰酸胍及20μl玻璃粉悬液 室温90分钟10000rpm离心1分钟，弃上清液 沉淀用300μl乙醇洗2次沉淀物中加入50μl反转录反应缓冲液，将RNA先转录为CDNA，再进行PCR上述核酸提取方法具有通用性，可用于任何其他病原微生物的核酸提取。 （三）二氧化硅（SE）或硅藻吸附法 除了玻璃粉以外，SE和硅藻（单细胞藻类的化石细胞壁，D）颗粒也具有特异吸附核酸的特性。Chaotropic试剂硫酸氰胍兼具细胞裂解及核酸失活两种特性，因而在高浓度硫氰酸胍存在下，从细胞（包括细菌）或病毒颗粒中释放出的核酸万分可结合于SE或D颗粒上 BOOM等利用硫氰酸胍和SE和D颗粒的上述特性，成功地从血清、尿液以及细胞中纯化了DNA和RNA，可在不到1小时内完成12个不同临床标本的核酸提取工作，其有Y/SE和Y/D两种提取方案，Y/SE方案为使用SE以提取血液和尿液等体液中的核酸；Y/D方案为使用D颗粒以提取细胞中的核酸。 1、Y/SE方案（1）试剂 裂解缓冲液L6：120g GUSCN溶于100ml 0.1mol/L Tris-HCl,PH6.4,然后加入0.2mol/L EDTA,PH8.0(用NaOH调节)溶液22 ml 及2.6g Triton X-100. 洗涤缓冲液L2:120G GUSCN溶于100mL 0.1 mol/L Tris-HCl,pH6.4,为使GUSCN溶解加快,可在60~65℃水浴下搅拌 (2)操作步骤50μl血清或尿液加入900μl裂解缓冲液L6及40μl SE 立即旋转混匀，5秒， 室温10分钟旋转混匀5秒，离心（12000×g）15秒用洗涤缓冲液L2将沉淀洗涤2次 再用70%乙醇洗2次，用丙酮洗1次 去掉丙酮，反应管开盖56℃干 燥10分钟 加入洗提缓冲液TE 混匀，56℃干燥10分钟12000×g离心2分钟上清液即含纯化的核酸  使用上述Y/SE方案，可以从血清或尿液中高产量地（通常超过50%）提取单链、双链、共价闭合或开环的DNA或RNA，其可作为限制性内切酶、DNA连接酶、反转录酶、大肠杆菌DNA多聚酶和TAQ DNA多聚酶的良好基质。 该方案虽适用于病毒及革兰阴性菌（如脑膜炎球菌、伤寒杆菌、淋球菌等）的基因组核酸提取，但不能直接从革兰阳性菌（如金黄色葡萄球菌、链球菌或酵母菌等）中提取核酸，原因可能是由于硫氰酸胍不能很好的裂解革兰阳性菌。 此外，在提取用于HBV-DNA检测的血清核酸标本时，由于HBV-DNA的长负链5`未端共价结合有蛋白质，而GUSCN不能将此蛋白从HBV-DNA上去掉，因此在上述提取方法中，由于有HBV-DNA结合蛋白的干扰，HBV-DNA难以从SE颗粒上洗脱下来。 为解决此问题，作者对上述方法分别作了两种改良，称为H方案和Y*方案。H方案是首先用SDS-蛋白酶K处理血清，使HBV-DNA长负链5`未端蛋白脱落，然后再按上述方法提取。 Y*方案是在用低盐TE溶液从SE颗粒上洗脱HBV-DNA时，在TE溶液中加入蛋白酶K，使HBV DNA从SE上脱落下来。这两种方案都可重复地从人血清中获得相同时的HBV-DNA，与用经典方法提取的DNA一样，可作为PCR的良好的检测标本。 2、Y/D方案 该方案与上述方案基本相同，所不同的是使用颗粒较大的D取代SE，以提取相对量多（10~20μg）的细胞基因组核酸，因为如使用SE，由于DNA分子多，一个SE颗粒可与数个DNA分子结合，从而在SE颗粒和DNA分子之间形成密实的网状结构，而成为聚集物， 即使是高速旋转也难以使其散开，使得核酸提取的后续步骤无法进行。而D颗粒较SE颗粒大得多，在D和核酸分子之间不会形成密实的结构，经旋转很容易散开 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37℃下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100℃干烤15分钟