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酶的提取与分离纯化 （制作人：王众 黄文辉 王晨） 要点 　１：细胞破碎 　２：提取 　３：沉淀分离 　４：离心分离 　５：过滤与膜分离 　６：层析分离 　７：电泳分离 　８：萃取分离 　９： 结晶 10：浓缩与干燥 　　　 1 细胞破碎 细胞破碎是通过各种过程使细胞外层结构破坏的技术过程。 细胞破碎的方法 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶促破碎法 机械破碎法 1 捣碎法 定义 利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。 使用范围 动物内脏 植物叶芽 细菌 2 研磨法 利用研钵，石磨，细菌磨，球磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。必要时加入石英砂等助磨剂。 使用范围 植物和微生物组织细胞的破碎 3 匀浆法 利用匀浆器产生的剪切力将组织细胞破碎的方法。 使用范围 易于分散，颗粒较小，比较柔软的组织细胞 也可以对捣碎法和研磨法产生的颗粒进行进一步研磨 物理破碎法 定义：通过温度，压力，声波等物理因素的作用是组织细胞破碎的方法。多用于微生物细胞的破碎 1 温度差破碎法 利用温度的突然变化﹑热胀冷缩的作用使细胞破碎的方法称为温度差破碎法 用于脆弱，易于破碎的细胞的革兰氏阴性菌，酶提取时 温度不能过高，难于用于工业生产 2 压力差破变化碎法 利用压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力破碎法。常用的有高压冲击法，突然降压法 及渗透压变化法 渗透压变化法是渗透压突然变化引起的细胞破碎的方法，此法特别适用于膜结合蛋白酶﹑细胞间质酶等的提取，但对革兰氏阳性菌不适合，主要是细胞壁由肽聚糖组成，能承受渗透压的突然变化。 3 超声波破碎法 利用超声波发生器所发生的声波或者超声波的作用，使细胞膜产生空穴（cavitation)而使细胞破碎的方法。 简便，快捷，效果好，特别适合微生物细胞的破碎，对数生长期的细胞进行破碎 化学破碎法 定义：通过各种学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法。 常用的化学试剂：甲苯 ，丙酮，丁醇，氯仿等有机溶剂 表面活性剂 ：特里顿（Triton）， 吐温（Tween) （非离子型） 原理：有机溶剂使细胞膜的磷脂结构破坏，改变细胞膜的通透性，低温下进行。 表面活性剂与磷脂及至蛋白相互作用，破坏细胞结构。 表面活性剂有离子型和非离子型两种。离子型对细胞膜的破坏性 效果较好，但会破坏酶的空间结构，故采用非离子型的。 酶促破碎法 定义：通过细胞自身的酶系或者外加酶制剂 的催化作用，使细胞的外层结构遭到破坏，而达到细胞破碎的方法。 自溶法：自身酶系， 取决于温度，ＰＨ，离子强度。 　　外加酶：　革兰氏阳性菌　　溶菌酶破坏β－１,４ 糖苷键 　　　　　　　　　　　酵母菌　　β－葡聚糖酶 水解 β-1，3-葡聚糖 　　　　　　　　　　　　霉菌　　几丁质酶 　　　　　　　　　　植物细胞　　纤维素酶，半纤维素 酶和果胶酶 ２提取 定义：在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液的过程，也成为酶的提取。 　　　　　　　　酶的主要提取方法 　　　　　　　　 提取方法 1盐溶液提取： 　　大多数蛋白酶都溶于水(P酶），而且在低浓度盐溶液条件下，酶的溶解度随着盐浓度的升高而增大的现象称为盐溶。当盐浓度达到一定的界限后，酶的溶解度随着浓度的提高而降低的现象称为盐析。 核酸类酶（R酶）的提取，一般在细胞破碎后，用0.14mol/L的氯化钠溶液提取，得到核糖核蛋白提取液，在进一步与蛋白质等杂质分离酶ＲＮＡ ２酸溶液的提取： 　　有些酶在酸性溶液的溶解度大，且稳定性好，宜用酸溶液提取，ＰＨ不能太低，以免使酶失活。胰蛋白酶可用（０．１２ｍｏｌ／Ｌ）的硫酸溶液提取 ３　碱溶液提取： 　　适用于在碱溶液溶解度大且稳定性好的酶　，例如Ｌ－天冬氨酸酰胺酶在　ＰＨ１１~１２的碱液提取。注意加碱液时要一边搅拌一边搅拌加入，以免局部过碱，造成酶失活。 ４有机溶剂提取 　　与脂质牢固结合且含有较多非极性集团的酶，可采用与水混溶的乙醇，丙酮，丁酮等有机溶剂提取，例如琥珀酸脱氢酶，