冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程.doc

冻干流行性乙型脑炎活疫苗制造及检定规程 本品系将流行性乙型脑炎（下称乙脑）SA14-14-2减毒株病毒接种于原代地鼠肾单层细胞，经培育后收获病毒液，加保护剂冻干制成。用于预防乙脑。 1　毒种 1.1　毒种来源 乙脑SA14-14-2减毒株病毒。由中国药品生物制品检定所检定与分发。 该毒株经用乙脑敏感动物试验证明其嗜神经毒力减弱，经检查无外源因子存在，用乙脑特异性免疫血清做中和试验证实为乙脑病毒，并经免疫力试验证明具有免疫原性，经临床观察证明安全有效。 1.2　生产毒种批制备 毒种启封后，在地鼠肾单层细胞上增殖传递，传递代数不得超过3代。从原始毒种算起，总代数不是超过10代。在传代细胞病变明显时收获病毒液，经检定合格后为生产毒种批。 1.3　毒种检定 1.3.1　无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行。 1.3.2　支原体检查 按《生物制品无菌试验规程》进行。 1.3.3　病毒滴定 抽样品做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6三个稀释度的病毒液，分别接种BHK21细胞，用蚀斑法进行滴定，病毒滴度≥7.2LogPFU/1.0ml为合格。冻干毒种批的滴度≥5.7LogPFU/1.0ml为合格。做病毒滴定同时应用参考苗进行滴定，以判断试验结果是否成立。 1.3.4　纯毒试验 生产毒种批与非同源性乙脑高价免疫血清混合，置37℃90分钟，接种地鼠肾单层细胞或BHK21细胞进行中和试验，观察5～7天判定结果。乙脑病毒完全被中和（无细胞病变或蚀斑出现）为合格，如仍有病变或蚀斑出现，应按上述方法再行中和。 1.3.5　脑内致病力试验 生产毒种批原液接种体重12～14g小白鼠10只，每只脑内注射0.03ml，接种后3天内死亡者不计，观察14天应活存。3天后如有小白鼠发病，应杀死取脑测定致病力，对小白鼠的脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时小白鼠皮下注射0.1ml10-1病鼠脑悬液进行皮下致病力试验，观察14天，应健存。 1.3.6　皮下感染人脑试验 生产毒种批原液接种体重10～12g小白鼠10只，每只皮下注射0.1ml，同时右侧脑内空刺，观察14天，应健存。 1.3.7　乳鼠传代返祖试验 生产毒种批原液接种3～5日龄乳鼠10只，每只脑内注射0.02ml。将发病的乳鼠杀死3只，解剖取脑测其致病力，用体重12～14g小白鼠测定，脑内毒力不应超过3.0LogLD50/0.03ml，同时皮下注射10只小白鼠，每只0.1ml10-1乳鼠脑悬液，观察14天，应健存。 1.3.8　外源因子检查 生产毒种批经非同源性乙脑高价免疫血清中和后，进行细胞培养试验。样品分别接种人二倍体细胞、BHK21细胞、原代地鼠肾细胞，于33～35℃进行培育，同时做对照培育。培育7、14天细胞应无病变，分别进行次代培育和血吸附试验；次代培育7、14天时亦分别观察细胞病变和进行血吸附试验。结果均无细胞病变并血吸附试验阴性为合格。 血吸附试验方法：观察到期的细胞，用0.2%～0.5%鸡、豚鼠红细胞混合液于4～8℃、20～25℃中依次进行血吸附检查。所用红细胞于2～8℃保存应不超过7天。 1.3.9　细胞基质外源因子检查 制备生产用种子批的细胞留取5%～10%不种毒，更换相应的维持液，置33～35℃培育。在培育7、14天时，镜下观察无细胞病变后分别做血吸附试验（方法同1.3.8项）。细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。 1.4　生产毒种批保存 液体生产毒种批于-60℃保存不超过6个月可用于生产；冻干生产毒种批于-20℃以下保存2年内可用于生产。 2　疫苗制造 2.1　细胞制备 2.1.1　地鼠 选用10～14日龄健康地鼠，解剖取肾。如发现肾脏异常或有乳糜状腹水，应废弃。 2.1.2　疫苗生产过程中不得使用青毒素或其他β内酰胺类抗生素。 2.1.3　细胞消化及培养 解剖取出肾脏后剪成碎块，用适量的胰蛋白酶液消化，将分散后的细胞悬液种入培养瓶内，加入生长液，置36～37℃培养。细胞生长成致密单层即可接种病毒。 2.1.4　外源因子检查 每批细胞留取5%～10%不接种病毒，加入与生产相同维持液后置33～35℃培育14天。在培育7、14天时分别做血吸附试验（方法同1.3.8项）。在观察期内细胞无病变并血吸附试验阴性为合格。如细胞出现病变或血吸附试验阳性，由该批细胞制备的病毒原液应废弃。 2.2　病毒接种和培育 挑选长成致密单层的细胞，用洗液充分洗涤后加适量维持液，病毒接种量为2.7～3.7LogPFU/1.0ml，置35～36℃培育。 2.3　原液 2.3.1　收获病毒液 种毒后培育72小时以上，细胞出现明显病变时收获病毒液，澄清过滤后为原液。 2.3.2　原液检定 2.3.2.1　无菌试验 每瓶原液分别取样做无菌试验，样品种入硫乙醇酸盐、乙良马丁和肝斜面培养基，培养