旧结核菌素制造及检定规程.doc

旧结核菌素制造及检定规程 本品系用结核菌的液体培养物，经杀菌后除去菌体，加温浓缩制成的粘性液体，含有结核菌的新陈代谢产物，对已受结核菌感染或曾接受卡介苗免疫的相体，能引起特异的变态反应。用以检查是否已受结核菌的感染及观察免疫反应。 1　菌种 1.1　由中国药品生物制品检定所分发或经同意。 1.2　制造旧结核菌素的菌种为人型结核菌。 1.3　菌种可冻干保存，亦可保存于骆（Lowenstein）氏培养基上，每3～6个月传代一次。 2　制造 2.1　启开菌种接种于骆氏培养基，置37℃培养2～3周，然后移种在苏通综合培养基或其他适宜培养基上，于27℃表面培育2～3周，再在甘油肉汤或苏通培养基上移种1～2代供大量接种之用。 2.2　接种 用接种环挑取一块生长良好的菌膜，轻轻移种于5%（ml/ml）甘油肉汤或其他适宜培养基的表面，菌膜应不下沉。 接种后37℃培育8～10周，要避免振动以免菌膜下沉。培育3周左右如培养瓶中菌膜未铺满表面，或培养期间有污染者应废弃。 2.3　杀菌 高压蒸汽121℃30分钟，或100℃流动蒸汽加热1小时。 2.4　杀菌后用无菌绒布或滤纸过滤除去菌体。 2.5　浓缩 滤液置蒸发皿中于75～80℃水浴上加温蒸发。应在通风柜内进行，并不时搅拌（亦可用其他方法）。浓缩至约为原量的1/10。 2.4　杀菌后用无菌绒布或滤纸过滤除去菌体。 2.5　浓缩 滤液置蒸发皿中于75～80℃水浴上加温蒸发。应在通风柜内进行，并不时搅拌（亦可用其他方法）。浓缩至约为原量的1/10。 2.5.1　浓缩后取样少许，进行效价测定（参见2.7.4项）。如效价较标准旧结核菌素为低，应再适当浓缩，如较标准为高，可加入适量灭菌蒸馏水或50%（ml/ml）甘油，再重新抽样测定效价，直至合格。然后，加入0.25%～0.5%（g/ml）苯酚或其他适宜防腐剂。 2.5.2　不同菌株生产的旧结核菌素可混合后进行浓缩，亦可分别浓缩，效价测定合格后混合。 2.5.3　浓缩后的旧结核菌素应放2～8℃最少1个月，使不溶解的物质析出并除去（如用离心沉淀法）。然后除菌处理，并做无菌试验。 2.6　分批 同日杀菌的旧结核菌素作为1批，　同时有数瓶者，按瓶分为亚批。 2.7　半成品检定 2.7.1　物理检查 旧结核菌素为深棕色澄明液体，不应含渣粒、沉淀物或其他杂质，并有特殊的气味。 2.7.2　无菌试验 按《生物制品无菌试验规程》进行。 2.7.3　安全试验 用体重300～400g的健康豚鼠2只，每只腹腔注射1.0ml，观察6周，豚鼠应活存。到期解剖，肉眼观察应夫任何进行性结核病变。如在观察期间豚鼠死亡，以加倍量动物进行复试。 2.7.4　效价测定 标准旧结核菌素由中国药品生物制品检定所发给。 2.7.4.1　动物试验 将标准及待检结核菌素分别稀释成1:1000、1:500、1:100等3个稀释度，用体重400～600g已致敏的白色豚鼠最少4只，去毛后于背部脊柱两侧相对部位分别皮内注射上述稀释度的旧结核菌素各0.1ml（从尾侧起先注射稀释度高者）。于注射后24、48、72小时各观察结果一次（亦可根据48小时的反应），算出待检和标准旧结核菌素的反应面积总和之比即为反应总面积比。同样也可求出标准旧结核菌素的平均反应）。比值1±0.1者为合格。 2.7.4.2　人体反应测定 动物试验合格后做人体反应测定，选择对旧结核菌素1个单位反应阳性的敏感成人最少4人，每人于两前臂内侧皮内相对部位分别注射10单位、5单位、2.5单位的标准及待检旧结核菌素各0.1ml，注射生24、48及72小时观察结果，并求出其比值（计算方法与2.7.4.1项相同）。不同浓度亦可不在同一人身上注射，但人数要增加，每个稀释度最少4人。 2.8　分装 物理检查、无菌试验、安全试验及效价测定合格后即可分装，分装后抽样做成品检定。 3　成品检定 包括物理检查、无菌试验、安全试验等，试验方法见2.7项。 4　保存与效期 保存于2～8℃暗处。自检定合格之日起效期为5年。 5　稀释旧结核菌素 5.1　稀释用的旧结核菌素应为经检定合格并未过效期者。 5.2　可用含有0.25%～0.5%(g/ml)苯酚或其他适宜防腐剂的生理盐水或缓冲生理盐水稀释，使每ml含50单位。 5.3　稀释旧结核菌素应进行无菌试验。防腐剂试验：用体重18～20g之健康小白鼠2只，每只皮下注射稀释旧结核菌素0.5ml。用苯酚作防腐剂量，小白鼠会出现战粟症状，但不应超过半小时，观察7天，不得有局部脓肿或死亡。 5.4　稀释旧结核菌素效期自检定合格之日起为42天。保存于2～8℃暗处。