高效液相色谱法指导培训讲义.ppt

 高效液相色谱法 日常维护和常见色谱故障 溶剂及样品的准备 －－过滤溶剂的目的湿防止固体颗粒损伤仪器或柱头；未经过滤的溶剂或者溶剂瓶中生长微生物，，都会降低溶剂入口过滤头的寿命，并影响泵的性能，一般要求两天过滤一次。 注意：过滤水相或有机相应该选用不同的滤膜 －－聚四氟乙烯几乎可以过滤所有的溶剂、酸和碱 －－尼龙66可以和大多数的有机物、水相容，但是建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMF －－纤维素滤膜用于水相 溶剂脱气的方法 －－氦气脱气 －－真空脱气 －－回流加热脱气 －－超身脱气（最为常用） 避免使用的溶剂 －－卤化物碱金属溶液及相应的酸溶液 －－高浓度的无机酸如硝酸、硫酸 －－能形成自由基的试剂及其混合物 －－四氯化碳和异丙醇或THF混合液 －－含强络合剂的溶液 色谱柱的平衡 为了确保分析结果的再现性，对于反相柱应使用5～10倍柱体积的流动相平衡色谱柱。 注意：新装到系统的色谱柱需要进行初始化。先断开柱子和检测器间的管路，用流动相将色谱柱中的原有流动相或气泡移出色谱柱，然后再将色谱柱和检测器间的管路接好。 保护色谱柱 过滤所有的溶剂和样品 使用保护柱 仪器使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液 柱子不使用时，两端密封 注意柱子使用的pH范围 不要高压冲洗柱子，不要高温下过长时间的使用硅胶键合相 常见色谱故障－基线噪音 可能的原因 －检测池脏 －检测器灯能量下降 －由泵引起的脉冲 －检测器上的温度效应 －检测池中有气泡通过 常见色谱故障－基线漂移 可能原因 －梯度洗脱引起 －流动相脏 －柱子没平衡 －系统中污染物溢出 RID检测器温度不稳定 常见色谱故障－鬼峰 鬼峰－没有进样就有色谱峰出现 原因－流动相脏，尤其是水相 常见色谱故障－压力过高 可能原因 －柱子进口过滤芯被污染 Purge阀过滤芯被污染 色谱柱被污染 连接管路堵塞 进样器旋转密封阀被堵塞 进样针或者针座被堵塞 可用分段法来检查哪一段发生堵塞 常见色谱故障－压力过低 溶剂进口过滤芯被堵 连接管路泄漏或其他备件泄漏 溶剂或流速的改变 主动阀失灵 四元比例阀失灵 单向出口阀失灵 柱子失效（固定相流失） 常见色谱故障－压力波动 可能原因 －溶剂进口过滤芯堵塞 －溶剂未脱气 －泵的密封圈老化 －出口单向阀失效 －主动阀失效 －最常见的原因失泵内有七宝 中等极性键合相——常见的有醚基键合相，这类键合相根据流动相的极性，可作为正相或反相色谱的固定相，应用较少。 极性键合相——可作正相或反相色谱使用 氨基键合相： 硅胶-氨丙硅烷基[－Si－(CH2)3NH2] 氰基键合相： 硅胶-氰乙硅烷基[－Si－(CH2)2CN] 键合相色谱pH控制在2-8 ZORBAX SB-C18键合相 使用独特的键合方式，用特殊的二异丁基硅烷对硅氧烷键进行保护，防止了极端pH和高温条件下键合相的水解，这些大侧链阻止了键合相的流失，提高了重现性，延长了柱寿命。 新型固定相 注意：pH范围0.8-8.0，最高操作温度90℃， 缓冲液浓度0.01-0.02M，避免使用磷酸盐与碳酸盐 ZORBAX Extend-C18色谱柱——采用C-18二齿结构并用特有的步骤进行双基封端。 在pH高达11.5的条件下，用于分离碱性、酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。 色谱柱使用注意点： pH范围2-11.5。使用有机缓冲液，浓度以10-50mM为好。在中高pH下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液， 最高操作温度60 ℃，最佳温度 ﹤40℃。 分离碱性物质，所用流动相pH值应高于被测物pKa一个单位。 SB C18 90℃ C8 60℃ C3 60℃ 苯基 60℃ 腈基 60℃ XDB 60℃ Extend-C18 60℃ 柱