2017年主管检验技师考试临床免疫学和免疫检验讲义第九章酶免疫技术.docVIP

第 PAGE 1 页 共 NUMPAGES 3 页 · 第九章　酶免疫技术 第一节　酶免疫技术的特点 　　它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。 　　　　一、酶和酶作用底物　　（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103～104个底物分子转变成有色产物。用于标记的酶应符合：　　1.酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。　　2.易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。　　3.作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。　　4.酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。　　5.酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。 　　（二）常用的酶　　1.辣根过氧化物酶（HRP）：目前酶联免疫吸附试验中应用最广泛的标记用酶。由无色的糖蛋白（主酶）和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ（HRP分别在403nm和275nm处的吸光度比值）表示，RZ值应大于3.0。　　RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP并不意味着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。　　酶活性以单位U表示：即1分钟将1μmol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变但活性降低，因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。　　2.碱性磷酸酶（ALP）：大肠杆菌来源的ALP分子量80kD，酶作用最适pH为8.0；小牛肠黏膜ALP分子量为100kD，最适pH为9.6；后一种ALP的活性高于前者。　　3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）：β-Gal来源于大肠杆菌，分子量540kD，最适pH6～8。因人血中缺乏此酶，以其制备的酶标志物在测定时不易受到内源性酶的干扰，从而提高特异性，被用于均相酶免疫测定。 　　（三）常用的底物　　1.HRP的底物　　（1）邻苯二胺（OPD）：是HRP最为敏感的色原底物之一。OPD在HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫酸或盐酸终止反应后呈棕黄色，最大吸收峰在492nm波长。OPD是ELISA中应用最早的底物，但其应用液稳定性差，易变色，需新配制后在1小时内使用，显色反应过程需避光，而且具有致癌性。　　（2）四甲基联苯胺（TMB）：TMB是一种优于OPD的新型HRP色原底物。TMB经HRP作用后变为蓝色，加入硫酸终止反应后变为黄色，最大吸收峰波长为450nm。TMB具有稳定性好，成色无需避光，无致突变作用等优点，已成为目前ELISA中应用最广泛的底物。缺点是水溶性差。　　（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）。　　2.ALP的底物　　常用对-硝基苯磷酸脂（p-NPP），p-NPP经ALP作用后的产物为黄色对硝基酚，最大吸收峰波长为405nm。　　3.β-半乳糖苷酶（β-Gal）的底物　　常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖苷（4-MUU），酶作用后，生成高强度荧光物4-甲基伞形酮（4-MU），其敏度性较HRP高30～50倍，但测量时需用荧光计。 　　　　二、酶标记抗体或抗原　　酶标记抗体或抗原是指通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或酶结合物。酶结合物是酶免疫技术的核心组成部分。酶结合物的质量直接影响酶免疫技术的应用效果。　　（一）酶标记抗体或抗原的制备　　用于制备酶标志物的抗原要求纯度高，抗原性完整（半抗原应先与大分子载体蛋白交联）；抗体则不仅需要特异性好、效价高、亲和力强以及比活性较高，而且还需要能批量生产和易于分离纯化。目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的Ig组分、Ig的Fab’和F（ab’）2片段等。　　酶标记抗体或抗原的方法有多种，标记方法一般应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定。标记方法有：　　1.戊二醛交联法　　可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过戊二醛偶联。一步法（连接ALP），二步法（连接HRP）。　　（1）一步法　　优点：操作简便、有效，而且重复性好。　　缺点：交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。　　（2）二步法　　先将HRP与戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗