细胞的冻存和复苏改进)2010.pptVIP

细胞的冻存和复苏 细胞的冻存的必要性 冻存的原理 为使细胞复苏时存活率最高 最佳的冻存条件： 尽可能地降低细胞内的晶体形成，减小细胞内水凝固所形成的高浓度溶质对细胞造成的低温损伤。 A) 缓慢冷冻 B) 用亲水的低温保护剂排除水分 C)在尽可能低的温度保存细胞 D)快速复苏 1.缓慢冷冻： 大部分培养细胞以1oC/min 降温时冷冻存活率最高。 常用方法 4oC离心收集细胞 细胞在冷的冻存液中悬浮 冰上5min -20oC冰箱30min -80oC冰箱过夜 液氮罐长期保存 2.用亲水的低温保护剂排除水分 在冻存液中加入细胞保护剂甘油或DMSO（二甲基亚砜）后进行冷冻。 DMSO相对于甘油而言：穿透细胞的能力强，保护作用好。 但有一定毒性，对某些细胞可能会诱导细胞分化。 细胞冻存所用培养基 用血球计数板计数细胞 目的： 量化细胞的浓度 应用： 传代中标准化细胞的浓度； 生存率的检测 检测潜在的损伤 基于细胞膜的完整性被破坏 最常用的是“染料排斥法测定细胞生存率” 常用染料为：台盼蓝、藻红和萘黑 注意：染料与细胞混合后不要放置很久（5-10min），否则活细胞会受到损伤而吸收染料。 5. 为了避免重复计算，压线的细胞只计算左线和上线者，右线和下线不计算在内。计数的细胞越多，计算的结果越准确。若要进行需精确定量的实验，所数的细胞数应在500~1000个。（a）如果视野内的细胞过少（100/mm2），需要额外计算中心大方格周围的一个或多个大方格（每个方格1 mm2）。（b）如果视野内的细胞过多（1000/mm2），只需计算大方格（1 mm2）对角线上的小方格。 细胞样品浓度的计算 计算公式：C=n/v C 是细胞浓度 （细胞数/ml) n是数过的细胞数 v是被计数的细胞体积 （ml） 血细胞计数室通常是1mm2X0.1mm 深 为 1X10-4ml 最终公式为：C=nX104 实 验 步 骤（细胞冻存） 用 品 器 材 超净工作台内： （共享） 污物缸1个、酒精灯2个、酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、微量移液器和枪头（5ml、1ml和50ul各一） （每人） 空EP管2个、 1640培养基（0.75ml）、胰酶（0.75ml）、Hank’s液 （H，1ml）、冻存液（锡纸， 1ml ）、冻存管1只、无菌袖套 本次实验的实验步骤一（每人做一份） 操作台内去除培养基，1ml Hanks洗细胞，再用胰酶（0.9ml）消化细胞；（如何？） 加入0.9ml完全培养基中止消化； 吹打；（充分地混匀细胞悬液使之尽量分散成单个细胞；尽量减少气泡的产生） 转入空2ml EP管（A）； 从中取20ul细胞悬浮液，放入另一个1.5ml EP管（B）； 两只EP管盖好后，拿出无菌操作台； EP管做好标记 实 验 步 骤 二 实 验 步 骤（冻存细胞的复苏） 用 品 器 材 超净工作台内： （共享） 污物缸1个、酒精灯2个、酒精棉球1瓶、大镊子1把、打火机1个、5ml移液器及枪头、枪架、1640培养基 （每人）培养瓶、无菌袖套 本次实验的实验步骤一（每人做一份） 取冻存管 （在干冰上，请注意安全！） 37oC水浴3min 24小时 给细胞换液 取细胞，显微镜下检查 * 10% DMSO 30% 血清 （FBS） 1% 青、链霉素 碳酸氢钠 59% RPMI-1640 细胞冻存用培养基 细胞生长用培养基 以较高的细胞浓度冻存细胞，细胞的存活率会高一些。 将细胞悬液滴到血细胞计数板小室的边缘，盖上盖玻片；（利用毛细作用使之充满计数板和盖片间的空隙。小室内的液体既不能多，也不能少） 2. 把计数板平放在显微镜载物台上； 3. 选择一个10X的物镜，利用网格线对焦； 4. 移动计数板，使镜下的视野恰好是整个网格区域中心的一个大方格（1mm2） 1mm 同时需要考虑悬浮细胞所用的总的ml数和样本的稀释倍数。 教室：枪头（50ul）、0.4%台盼蓝溶液、血细胞计数板、盖玻片 教室对面：离心机 无菌操作室 教室对面: 将EP管（A）配平后，放入离心机，4oC，1000g， 10min离心 无菌操作室 将EP管A离心后，小心带回无菌操作台，去上清； 余下的细胞沉淀，加入0.5ml细胞冻存液，使细胞悬浮，转入细胞冻存管；冻存管 上做好标记；放入无菌准备间中的冰盒5min；放入-20oC， 30min；放入-80oC过夜；液氮长期保存。