基础学习实验 2-食管癌细胞系总蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离鉴定PPT课件.pptVIP

食管癌细胞系及总蛋白提取 总蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定 食管正常细胞与食管癌细胞的差异蛋白鉴定;食管癌是我国常见的恶性肿瘤 在消化道恶性肿瘤中仅次于胃癌 发生于食管粘膜上皮 绝大多数为鳞癌、小部分为腺癌;中国是食管癌死亡率最高的国家, 在六大食管癌高发区中 ,只有潮汕高发区地处中国南部和沿海地理位置,其中,又以南澳县最高,食管癌粗死亡率在 100/ 10万以上,其次为揭阳和饶平地区。与中国其它食管癌高发地区相比较,该地区在地理位置、气候条件、居民的生活习惯等方面均有明显不同。;食管癌细胞系及总蛋白提取;细胞系（cell line） 原代细胞培养物经首次传代成功后所繁殖的细胞群体。 也指可长期连续传代的培养细胞。 肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。 已在细胞遗传学、分子遗传学和生物医学等方面得到越来越广泛的应用.其已被用于基因定位、检测理化因素的毒性和细胞因子活性、生产单克隆抗体、制备组织工程化人工器官和转基因动物等方面,更是研究发育生物学、肿瘤发生学、肿瘤治疗等不可或缺的材料. ;;⑷易于被凝集素凝集 癌细胞凝集性增强是由于质膜结构发生深刻变化所致。糖蛋白在质膜中的运动性增强，因而凝集素更容易将其受体（糖蛋白）簇集，形成更多的横桥。质膜糖蛋白运动性增强还可能是由于与其相连的微丝受到破坏所致。 ⑸粘壁性下降 葡糖胺聚糖是构成细胞外基质的主要成分，可形成水合凝胶。癌细胞合成葡糖胺聚糖减少，导致细胞粘壁性能下降。 ⑹细胞骨架结构紊乱 癌细胞中微管变短，排列紊乱，微丝亦发生结构异常。肌动蛋白丝的量减少，引起质膜流动性增强，细胞属性发生改变。由于细胞骨架结构紊乱，导致细胞外形亦发生改变。例如培养中的正常成纤维细胞呈扁平梭形，但被鸟类肉瘤病毒（含src癌基因）转化后，则变成球形，表面出现小泡，此即由于细胞骨架成分紊乱所致。;食管癌细胞系 Ec109;食管癌细胞系 EC9706;食管癌细胞系 KYSE150;食管癌细胞系 KYSE180;准备凝胶电泳的样品，需要对细胞和组织进行裂解以释放目的蛋白，这些可??性蛋白能够穿过分离胶单独移动。;蛋白样本制备的原则;学习SDS测定蛋白质分子量的原理 掌握垂直板电泳的操作方法 了解蛋白印迹技术原理和方法;带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现象称为电泳。 电泳使用不同的支持介质，早期有滤纸、玻璃珠、淀粉粒、纤维素粉、海砂、海绵、聚氯乙烯树脂；以后有淀粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜，现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和琼脂糖凝胶。; 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N,N,N?,N?-四甲基乙二胺(N,N,N?,N?-tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。 ;聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）。 1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小。;SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。因此蛋白质在含有强还原剂的SDS溶液中与SDS分子结合时，可形成SDS-蛋白质复合物。这种复合物由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。 SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，使蛋白复合物分解成多个亚基。 因此在电泳时，蛋白质分子的迁移速度则主要取决于蛋白质（亚基）分子大小。 使聚丙烯酰胺凝胶具有分子筛效应。;当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX 式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。;被分离物质分