免疫标记技术和分析应用.ppt

免疫标记技术和分析应用; 用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂、胶体金或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。;荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。;免疫标记技术;反应类型; 用标记物标记抗体或抗原进行抗原抗体反应借以提高免疫学诊断的敏感性;免疫荧光技术; 将抗体或抗原标记以荧光素，然后与相应抗原或抗体结合，形成的免疫复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，借助荧光检测仪测定或定位被检抗原或抗体。 当出现荧光时，表明标记抗体存在，相应的抗原也存在。;;抗体的荧光素标记;常用的荧光素;;去除游离荧光素及其降解产物：透析或凝胶过滤 去除荧光素未结合和结合过度的抗体：阴离子交换层析法 去除交叉反应或非期望抗体：动物肝粉吸收或固相抗原吸收;荧光检测仪 ;荧光显微镜; 荧光显微镜的种类 透射式 落射式;荧光显微镜的构造;;;（1）直接荧光染色法;直接法 ;;;（2）间接荧光染色法 ;直接法 ;;（3）补体荧光染色法 ;;;;免疫酶技术;;抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。; 将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。 滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。;优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。;缺点： 标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。 ;一、常用的酶及其底物;;二、 标记方法;戊二醛交联法：抗原-戊二醛-酶 改良过碘酸钠标记法：过碘酸钠氧化酶的羟基为醛基，再与抗体蛋白的氨基结合。HRP-CH2-NH-IgG ;三、酶标记物的纯化及鉴定;2、鉴定 免疫活性鉴定：免疫电泳/双扩/ELISA 酶标记率测定：分光光度法;四、酶标仪（酶联免疫检测仪）;返回;;;;免疫标记技术;酶联免疫吸附试验;ELISA基本实验过程;ELISA原理图;固相抗原或抗体;酶 ;DNM-9602G酶标分析仪;1. 直接法 2. 间接法 3. 夹心法 4. 竞争法 5. 捕获法;1.直接 法;direct ELISA—for Ag;direct ELISA—for Ab;2. 间接法;;;包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体 ;3. 夹心法：;;获得待分析物的未标定抗体;;双夹心法;4. 竞争法;;竞争法的原理;用已知特异性 抗体包被 固相载体 ;;;（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。;食品中盐酸克伦特罗的测定 食品中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 赭曲霉毒素 ） 食品中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ）;河豚毒素 ; ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ;ELISA试剂盒;放射免疫分析;利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术 灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质;Rosalyn Yalow （美国）; 与此同时，Ekins利用竞争性蛋白结合分析技术测定甲状腺素获得成功 开创了生物活性物质微量测定技术的新时代，是微量分析方法学上的一个突破。;放射免疫技术;结合相;;胶体金标记技术;　 胶体金是由氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠和鞣酸等作用下，聚合成特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，故称为胶体金。 利用它在碱性环境中带负电荷的性质，与蛋白质分子的正电荷基团藉静电吸引而形成牢固结合，除抗体蛋白外，胶体金还可与其他多种生物大分子结合。;吸附在胶体金表面的抗原或抗体能定向将胶体金颗粒运载到组织或细胞内、固相载