内毒素和其去除.ppt

内毒素和其去除 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 内毒素也称为脂多糖或LPS，是革兰氏阴性菌胞壁上一种成分（少数阳性菌也能产生）。其细胞壁外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成 ，死亡时则会释放大量内毒素。一个大肠杆菌细胞约含有200万个LPS分子 内毒素是什么 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 疏水性，毒性部分 结构复杂，特异性部分 带负电 功能部分 构建生物经济体系 打造生物经旗舰 结 构 不同的革兰氏阴性细菌,其 LPS的化学组成有一定的差别,但都含有内脂 A 部分 内毒素性质 极高的热稳定性 250℃30分钟 带负电 等电点在2左右 亲水兼疏水 糖亲水 脂疏水 单体 胶束 囊状 内毒素存在形式 构建生物经济体系 造生物经济旗舰 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 内毒素的危害 0.5—1 小时 冷颤 发热，头痛 恶心，呕吐，脸色苍白 血液循环障碍 休克 死亡 医药制剂 本身不合格或放置时间过长 输液器 未消毒彻底 注射器 操作污染 2ng/kg体重即能引起发热 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 药品、生物制品的细菌内毒素限值（L，EU/mg）一般按以下公式确定： ? K 为人每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，单位 EU/（kg · h） M 为人每公斤体重每小时的最大供试品剂量，单位mg/（kg · h） 生物制品中内毒素标准 细菌内毒素标准在制定时应定为计算值的1/3~1/2。 我国药典要求注射剂中细菌内毒素＜1EU/ml 凝胶法 浊度法 显色 基质法 内毒素与鲎试剂的凝胶反应 大于0.03EU/ml范围 缓慢翻转180°，目测终点 0.006-300EU/mL 浊度变化 0.006-15EU/ml 显色基团吸光度变化 简单,经济, 不需专用测定设备 特异性不强 精密度、定量性差 简单、快速、灵敏度高、检测范围宽 需精密的专用仪器 精度高、灵敏度高 仪器和试剂贵,操作比较复杂 部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰，因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验 常用内毒素检测方法 内毒素去除的难点 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 自身特点 极少的养分G-即可存活，内毒几乎无处不在 单体、聚集体种类繁多 性质不均一 热稳定性高 180℃ 3 hours 相互作用 本身带负电，可以和带正电的碱性蛋白结合 通过二价阳离子(如Ca2+) 的桥接作用和酸性蛋白形成复合体 类脂A的疏水特性导致其和疏水性蛋白结合 内毒素 去除内毒的方法 1.高温烘烤 热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。此法适合玻璃器皿的去内毒 2.碱消毒（室温条件下） 主要用于玻璃、 塑料和其它高分子材料器皿上内毒素的去除 4.蒸馏法，超滤法，反渗透，此法一般在生产注射用水时用到，蒸馏需要多级蒸馏并且加隔沫装置，反渗透成本高。 5.吸附法，内毒素在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于对蛋白有吸附故不适合用于生物制品。 6.层析法，选用合适的层析填料和溶液体系，能够有效去除产品中的内毒素，是目前单抗纯化生产中的主流工艺。 内毒素去除方法存在选择性差，样品回收率低等问题。下面主要介绍几种生产中常用的方法 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 7.相分离法、适用于蛋白制品，但各有缺点。 相分离法Triton X-114 一 阴离子交换层析 二 亲和层析 四 疏水层析与分子筛 三 相分离法Triton X-114 此法用于较大重组蛋白质（rCK-bb、Rck-mb）中LPS的去除，经过三次相分离后，LPS从104 EU/ml降到了几个EU/ml，去除率超过97%，蛋白的回收率大于90%。 适用于亲水性蛋白的内毒去除，会使一些有毒的 Triton X-114 残存在蛋白溶液中 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 离子交换层析的速度快、载量高、浓缩效应好,在早期下游纯化中担当重要角色。一般而言,内毒素比蛋白质在阴离子交换介质上的结合强很多,分子量越小的内毒素结合得越强,多数要在柱再生(1M氯化钠) 或在位清洗(1M氢氧化钠)时才从介质上洗脱下来 构建生物经济体系 打造生物经济旗舰 阴离子交换层析 内毒素在pH〉2时都是带负电。阴离子层析填料自身带正电能够吸附内毒。可使用流穿模式，上样前样品PH控制在目的蛋白PI以下，使其带正电。这样内毒素结合在填料上，目的蛋白直接流穿 如二乙胺乙基（DEAE）阴离子交换介质适于从碱性蛋白质（即带正电的蛋白质，如尿激酶）中去除内毒素， 成本低，吸附容量大，但这种方法不适用于带负电荷的蛋