人胰岛素制备生物技术制药.pptVIP

制备基因工程药物的基本过程 一，获取目的基因 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA的提取 : 取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA： 取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。 将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。 （二）mRNA转录合成cDNA第一链 cDNA 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检验），  混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。  （三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链 通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，