口腔细胞培养与其应用.ppt

口腔细胞培养及其应用 武汉大学口腔医学院 郭继华 第一节 细胞培养 一、 细胞培养的基本原理 细胞培养：模拟体内的生理环境，在适当的条件下，使活体组织细胞在体外环境存活、生长增殖，并维持其结构功能。 培养细胞的形态特点 贴壁型细胞： 必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞 按照培养细胞的主要形态，可分为几大类型 成纤维细胞型 胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状、火焰状、漩涡状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌细胞等等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。 上皮型细胞 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜，生长时呈膜状移动，起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。 游走细胞型 　　在支持物上呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 多型细胞型 　　有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。 悬浮型细胞： 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面，见于某些癌细胞和血液淋巴细胞 培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长 　　　 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来自血，脾或骨髓 在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 　　易于收获，可获得稳定状态 观察不方便 培养细胞的生长和增殖过程 培养细胞生命期 　　所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。 原代培养期：　　也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互依存性强。细胞独立生存性差。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。 传代期：　　初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。 衰退期：　　此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。无限细胞系的形成主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。 培养细胞一代生存期 　　所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第n代细胞，即指该细胞系已传代n次。在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段： 潜伏期（游离期，贴壁期） 对数生长期 停止期（平台期） 潜伏期：　　细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。各种细胞贴附速度不同，这与细胞的种类、培养基成分和底物的理化性质等密切相关。 　　 初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附。细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程。支持物能影响细胞的贴附；底物表面不洁不利贴附，底物表面带有阳性电荷利于贴附。另外在贴附过程中，有一些特殊物质如纤维连接素，细胞表面蛋白等也参与贴附过程。这些物质都是蛋白类成分，它们有的存在于细胞膜的表面，有的则来自培养基中的血清。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一。 　　初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。