DNA的复制生物化学.ppt

* * * * TopoI和TopoII松弛DNA负超螺旋 Topo II(gyrase)催化改变DNA互绕数 Gyrase，回旋酶，促旋酶（大肠杆菌的II类拓扑异构酶，可在DNA中引入负超螺旋。 由Topo II参与的各种反应 (a) 松弛 (b) 连环与去连环 ( c) 打结与去结 DNA复制过程中形成的链状分子(catenanes) 需要拓扑酶来帮助解离 Other proteins involved in DNA replication of E. coli 1. DnaA等蛋白质结合到大肠杆菌复制起始位点oriC的特征核苷酸序列上 2. 解旋酶(Helicase)帮助将双链DNA解旋成单链DNA 3. SSB (单链DNA结合蛋白) 与单链DNA结合帮助稳定单链结构 4. Primerase合成RNA片段 5. DNA 聚合酶III以RNA片段为引物开始合成DNA 6. DNA复制叉(replication fork)的形成, DNA合成向两个方向同时进行, 滞后链(lagging strand)上的Okazaki片段不断被连接成大片段 7. 拓扑异构酶 (Topoisomerases) 帮助消除复制过程中DNA螺旋产生的纠缠 8. RNA引物被DNA聚合酶I去除,补齐缺口; 9. 最终由连接酶连接成完整的染色体DNA. RNA引物由DNA聚合酶I的5’?3’外切酶活性除去 RNA primer 小结： ⑴ DNA解螺旋酶解开双链DNA。 ⑵ SSB结合于DNA单链。 ⑶ DNA旋转酶引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。 ⑷ DNA引物酶(在引发体中)合成RNA引物。 ⑸ DNA pol.Ⅲ在两条新生链上合成DNA。 ⑹ DNA polⅠ切除RNA引物，并补上DNA。 ⑺ DNA ligase连接一个冈崎片段。 DNA复制过程中，聚合酶对dTTP和dUTP的分辨能力高,有少量dUTP掺入DNA链中，此时，U-糖苷酶、AP内切酶、DNA polⅠ、DNA ligase共同作用，切除尿嘧啶，接上正确的碱基。 真核生物DNA的复制的特点 真核生物DNA的复制与原核生物的有很多不同，如真核生物每条染色体上可以有多处复制起始点，原核生物只有一个；真核生物的染色体在全部完成复制之前，每个起始点上DNA的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起始点上可以连续开始新的DNA复制，表现为虽只有一个复制单元，但可以有多个复制叉。 真核生物细胞中，DNA复制只是细胞周期的一部分，只在S期进行。第一批复制子的激活标志着S期的开始，在之后的几个小时里，其余的复制子相继启动。 真核生物的复制子相对较小，约在40-100 kb。 真核生物复制起始区的特点 到目前为止，酿酒酵母的复制起始位点已被签定，长约150 bp，包含数个复制起始必需的保守区。将这个特殊序列作为一个部件来构建一个环状的DNA分子，这个核外DNA分子在酵母中能够自主复制。这个序列被称为自主复制序列（autonomously replicating sequences, ARS）。 后来在其他真核生物中也发现类似ARS元件的序列。 真核生物DNA复制起始需要起始点识别复合物（origin recognition complex, ORC）参与。 真核生物DNA复制叉的移动速度大约只有50 bp/s，不到大肠杆菌的1/20，因此人类DNA每间隔30000-300000个碱基就有一个复制起始点。 性质 DNA聚合酶? DNA聚合酶? DNA聚合酶? DNA聚合酶? DNA聚合酶? 亚基数 4 1 2 2~3 ?1 分布 核内 核内 线粒体 核内 核内 功能 DNA引物合成 损伤修复 线粒体DNA复制 主要DNA复制酶 复制修复 3’→5’外切 无 无 有 有 有 5’→3’外切 无 无 无 无 无 已发现的真核生物DNA聚合酶有15种以上，哺乳动物细胞中主要有5种。 真核生物DNA聚合酶与细菌DNA聚合酶的基本性质相同： 以dNTPs为底物 需镁离子激活 需要模板链 需要具有3’-OH末端的引物 链延伸方向：5’→3’ 但一般都不具备核酸外切酶的活性，推测一定有另外的酶在DNA复制中起校正作用。 真核生物DNA的复制过程 公认的说法： 在复制叉上存在一个DNA聚合酶?/引发酶复合体和另外两个DNA聚合酶复合体。这两个聚合酶中一个是聚合酶?，另一个是第二个聚合酶?或聚合酶?，前者延伸前导链，后者合成后随链的冈崎片段。 冈崎片段RNA引物的除去分两步，首先一种可特异性切除DNA-RNA杂合底物的RNase H1发挥核酸内切酶的活性，在靠近RNA与DNA的连接处切开引物，又具备5’-3’核酸外切酶活性的FEN1蛋白降解RNA。最后，由DNA连接酶I将相邻