福林酚测蛋白质 （一）.pptVIP

福林-酚法测定蛋白质的含量 实验目的 学习测定蛋白质浓度的原理和方法 熟练分光光度计，微量移液器的操作以及标准曲线的制作 实验原理 第一步——双缩脲反应（蛋白质与碱性铜试剂反应） 实验原理 实验方法 实验方法 实验方法 以0号管为空白对照，在分光光度计上以波长650nm比色，读取光密度 值（OD值），标准蛋白含量μg （或者标准蛋白浓度）作为横坐标，OD 值作为纵坐标，制作标准曲线写出回归方程，根据待测样品OD值计算蛋 白质含量。 注意事项： 及时做好标记 加入试剂后应立即混匀 测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内 分光光度计的使用方法 设置波长 设置样品池个数 调零 测定 开启机器，调节所需的波长，设置样品池个数 空白对照管调零（一定放在离自己最近的那个样品池） 将待测样品液放入比色皿（2/3高度），并将比色皿放入样品池内，盖好盖子，测光密度值（OD值），按上下键翻看其他样品池的数据 测量完毕，一定把比色杯用自来水和蒸馏水重新洗净，倒置于滤纸上晾干  比色皿有光面和毛面，勿用手触摸光面，使用时光面对准光路。 装液体时，需达到比色皿2/3左右；若液体不慎溢出，需用纸巾吸干，仪器如果沾有液体，请迅速擦干。 微量移液器的使用 原理 微量移液器是根据“虎克定律”设计的，“在一定限度内弹簧伸展的长度与弹力成正比”：也就是微量加样器吸入液体的容量与加样器内的弹簧拉伸长度成正比。 常见种类 0.5～10μl 5～50μl 10～100μl 20～200μl (读数窗显示20～200, 每转1档1μl) 100～1000μl(读数窗显示100～1000, 每转1档为 5μl) 操作步骤 1：选择量程 根据转移液体的量，选择正确量程的微量移液器 2：调节吸量体积： 将微量移液器调至所需体积，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值； 操作步骤 3：吸量 用移液器的吸杆插上合适的吸头，旋紧。 握紧微量移液器，用大拇指按至第一档，将吸头插入溶液中。 然后松开大拇指，慢慢释放按钮以吸取液体（否则液体进入吸嘴太快，导致液体倒吸入移液器内部）；然后将微量移液器移出液面。 释放液体时，枪头接触在容器壁上，先慢慢按至第一档，停留1～2秒后，再按至第二档以排出所有液体。 操作步骤 4. 更换吸头： 吸取不同的液体，一定要更换枪头，防止试剂交叉污染，更换枪头时，对着废弃桶，轻轻按下卸载吸头的弹射器，吸头自然脱落在废弃桶内。 5. 微量移液器的放置： 实验完毕后，将移液器调回到接近最大量程，使弹簧处于松弛状态，放到或者悬挂在架子上。 注意事项 1. 吸取不同的液体时，切记要更换吸头， 2. 调节移液器时，动作要轻缓，千万不要将读数的调节超出最大值和最小值，否则会造成损坏。 3. 吸取液体时，动作要轻缓，防止液体随着气流进入移液器的上部； 4. 带有残余液体吸嘴的移液器不能平放。 5. 每次实验完毕后将微量移液器调至接近最大刻度，使弹簧处于自然伸展状态。 6. 必须定期让专业人员进行校正，不能火烧灭菌，不能摔。 常用的测定蛋白质含量的方法 1：双缩脲法 2：福林酚法 3：考马斯亮蓝法 4：BCA法 5：紫外吸收法 6：凯氏定氮法 * * 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物 第二步——与福林-酚试剂反应 在碱性条件下 ，这种被作用的蛋白质上的酚类基团极不稳定，很容易还原福林酚试剂中的磷钨酸和磷钼酸，生成钨蓝和钼蓝的混合物，呈蓝色。 可利用分光光度计测得650nm的OD值，浓度大小跟OD值成正比y=kx+b OD值是optical density（光密度）： 入射光强度与透射光强度之比值的常用对数值 分光光度计的原理 制作标准曲线： (1）选择标准蛋白溶液(牛血清白蛋白），配制一定浓度母液 配制标准溶液浓度梯度，测定对应的OD值 (3）根据浓度和OD值得回归方程即标准曲线 利用excele软件 如何制作？ 如何评估？ x1………y1 x2………y2 x3………y3 . . . .Xn………yn y=kx+b 迅速摇匀，室温放