荧光定量PCR技术原理及应用讲座.pptVIP

Questions? 在扩增曲线上，可以调节的一条水平线。告诉软件到哪里获得分析数据 * 在扩增曲线上，可以调节的一条水平线。告诉软件到哪里获得分析数据 * 引物长度（17 bp-25 bp）为佳。太短的引物容易导致扩增效率降低；太长的引物会导致出现引物高级结构的几率增加。两者都会干扰定量结果的准确性。 2）.引物的3’端应尽量避免高GC或高AT含量区域。 3）.引物3’端最后一个碱基最好为G或者C，避免使用T。 4）.正向引物和反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃。Tm值调整至60℃-65℃度为佳。（引物Tm值推荐使用Primer 5进行计算） 5）.引物的GC含量控制在40%-60%之间为好，最佳为45%-55%之间。 6）.引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀，避免使用GC或者TA含量高的区域，尤其是3’端，必须避开GC含量不均匀的区域。 7）.引物设计时请尽量避开T/C或者A/G的连续结构。 8）.避开引物内部或者两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。二条引物之间的3’端避开有2个碱基以上的互补序列。 9）.引物设计完毕请使用NCBI BLAST功能检索核对引物特异性， 以避免非特异性扩增产生。 * 线性图谱 对数图谱 qPCR图谱分析及常用名词 基线、阈值、CT值 线性图谱 对数图谱 qPCR图谱分析及常用名词 基线设置 软件自动选择基线区域（默认基线期为3-15） qPCR图谱分析及常用名词 案例：扩增曲线下降 仪器默认基线 重新设置基线 qPCR图谱分析及常用名词 基线、阈值、CT值： 阈值（ Threshold）—可以相信的最低荧光值 阈值决定ct值 qPCR图谱分析及常用名词 基线、阈值、CT值： 阈值（ Threshold）—可以相信的最低荧光值 阈值 qPCR图谱分析及常用名词 阈值设置 qPCR图谱分析及常用名词 手动调节阈值 qPCR图谱分析及常用名词 基线、阈值、CT值 线性图谱 对数图谱 基线期与指数期 接合部 扩增曲线与阈值 的交点 qPCR图谱分析及常用名词 Ct：18-28 or 15-33 样品如何稀释？ Ct值有效性判断 溶解曲线（Melt Curve）单峰 无模板对照（NRT）Ct值为A1，模板Ct 值为A2 A1-A2 5 Ct值有效右缘：无模板阴性对照（NTC）的Ct值-3 荧光定量PCR数据有效性国际标准 线性关系以及扩增效率确认： 标准曲线相关系数（R2） 0.98 标准曲线斜率介于-3 ~ -3.5之间 PCR扩增效率（E）介于0.9 ~ 1.2之间 重复性确认： 重复管之间的STD 0.2 特异性确认： 扩增产物溶解曲线无明显非特异性扩增产物/引物二聚体杂峰 qPCR图谱分析及常用名词 内参基因的选择 引物设计 实验设计 布板 图谱分析及常用名词 相对定量的数据分析 绝对定量的数据分析 qPCR分析 公式--2-ΔΔCt： Ct处理 – Ct 内参(处理)= ΔCt处理 ； Ct对照 – Ct 内参(对照)= ΔCt对照 ΔCt处理 – ΔCt对照 = ΔΔCt 倍数差异 = 2-ΔΔCt 处理 对照 相对定量的数据分析 案例分析： 样品 待测基因Ct值 内参Ct值 对照 处理 28.4 25.9 17.9 18.2 2-△△CT法计算处理前后表达水平的倍数差异： ΔCt处理 = 25.9 - 18.2 = 7.7 ΔCt对照 = 28.4 - 17.9 = 10.5 ΔΔCt = ΔCt处理 - ΔCt对照 =7.7 - 10.5 = -2.8 倍数差异 = 2-△△CT = 2-(-2.8) = 6.9 相对定量的数据分析 处理后，基因上调表达，表达倍数为6.9倍 内参基因的选择 引物设计 实验设计 布板 图谱分析及常用名词 相对定量的数据分析 绝对定量的数据分析 qPCR分析 绝对定量PCR： 根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx 个拷贝 标准品的类型： 测什么用什么，仅限基因组 使用质粒为标准品。（注：cDNA不能作为标准品） 绝对定量的数据分析 质粒标准品的制备： 绝对定量的数据分析 PCR 目的基因克隆 质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 拷贝数的计算： 平均分子量（MW）:dsDNA=(碱基数) x (660 道尔顿/碱基)ssDNA=(碱基数) x (330 道尔顿/碱基)ssRNA=(碱基数) x (340 道尔顿/碱基) 拷贝数计算公式:(6.02 x 1023拷贝数