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微生物发酵法生产抗癌药物紫杉醇 二.微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线 三.提高内生菌紫杉醇的产量的方法 一、紫杉醇的概况和作用机制 红豆杉树 一、紫杉醇的概况和作用机制 紫杉醇（Paclitaxel,商品名Taxol）的概述： 1963年美国化学家瓦尼（M.C. Wani）和沃尔（Monre E. Wall）首次从一种生长在美国西部大森林中称谓太平洋杉（Pacific Yew）树皮和木材中分离到了紫杉醇的粗提物。 1971年Wall 和Wani将粗提物进行纯化，并确定了其化学结构（一种四环二萜化合物，并把它命名为紫杉醇（taxol））。 2001 年Huang Q 等通过实验获得紫杉醇生物合成的重要中间产物紫杉二烯( Taxadiene, 产量达13mg/L) , 成为基因工程菌合成紫杉醇中间体的先例。 紫杉醇发现到临床应用大约经历了30 年的时间。 注：紫杉醇是一种复杂的具有抗癌活性的三环二萜类生物碱。 紫杉醇的作用机制 它作用于细胞微管，通过与微管蛋白N端第31位氨基酸和217~231位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使维管束不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于G2/M期，导致有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞增殖或肿瘤体积逐渐缩小。 那么人们根据紫杉醇作用机制，研究出来紫杉醇能治疗什么疾病呢？ 紫杉醇的临床作用 紫杉醇有抗肿瘤、抗癌作用。可治疗卡波济氏肉瘤(一种艾滋病人特有的恶性肿瘤)、直肠癌、膀胱癌和转移性乳腺癌等一系列的棘手肿瘤 ；可治疗卵巢癌、肺癌。 紫杉醇具有抗类风湿性关节炎、抗疟的作用, 对中风、早老性痴呆和先天性多囊肾病、头部和颈部肿瘤、恶性黑色素癌和肉瘤等, 均展 现出一定疗效。 紫杉醇还可诱导细胞凋亡, 另外还有类似脂多糖( LPS) 的作用, 可调节机体的免疫功能 。 有人估计，治疗一个卵巢癌患者需要6 棵树龄60~ 100 年的红豆杉树。但紫杉 醇已经广泛使用, 并成为抗肿瘤的主流药物之一。对紫杉醇的需求越大，对红 豆杉树和环境都会造成严重的伤害。后来，人们发现了微生物发酵法 二 微生物发酵法生产紫杉醇的技术路线 实验材料 罗汉松的树皮 实验方法 1 内生真菌分离 2 内生真菌纯化、鉴定与保存 3 发酵培养 4 发酵产物的处理 （紫杉醇的提取、纯化、含量测定） 1 内生真菌分离 1）对植物组织表面进行消毒, 以控制表生真菌的生长, 使内生真菌得以分离。其分离方法是先用水冲洗已剪碎的植物材料, 然后在75%乙醇中浸泡3min 后,最后用无菌水冲洗。 2）分离所用的培养基为PDA 培养基。为了防止细菌污染可在培养基中加抗菌素, 如链霉素、四环素等。温箱中28 ℃培养3-4 d 后观察. 在分离内生真菌时常添加一些宿主植物的提取液，以满足内生真菌的一些特殊的营养需求 2 内生真菌纯化、鉴定与保存 待培养基上初步长出菌落后，选择长势较好的菌落，挑取菌丝到PDA平板上纯化，根据经典形态学方法鉴定菌种。纯化的菌株在PDA斜面4℃下保持，备用。 3 发酵培养 从PDA 平板上切取5 mm × 5 mm 小块菌落,接种至装有150 mL 液体培养基的500 mL 三角瓶中, 于28 ℃ , 100 r/ min 摇床上振荡培养10-14 d. 4 发酵产物的处理 1）紫杉醇的提取 常用的有机溶剂：甲醇、乙醇、氯仿、二氯甲烷、乙酸乙酯等 提取原则：能够充分萃取出发酵液和菌丝中的紫杉醇 具体方法： 发酵液过滤后, 菌丝研磨（加适量石英砂），滤液称量体积。 滤渣烘干( 低于50℃) ,滤渣用适量乙酸乙酯萃取, 滤液用1/2 滤液体积的乙酸乙酯萃取( 30min) , 下层水层再用乙酸乙酯萃取一次, 合并乙酸乙酯,减压蒸馏。 用适量甲醇洗涤减压蒸馏得到的固体, 再用正己烷洗涤15min, 收集下层甲醇, 加入乙酸乙酯和水( 1：1) 进行萃取( 30min) , 将收集的乙酸乙酯进行减压蒸馏, 用一定量的乙腈洗下固体, 0 ℃密封保存。 2）紫杉醇的纯化 紫杉醇的纯化多采用色谱法。已报道的用于紫杉醇分离的方法除薄层色谱法、柱层析法外还有胶束电动毛细管色谱法、高速逆流色谱法、树脂吸附分离法、膜分离法、沉淀法、化学反应法和药理作用靶点法 。 3）紫杉醇含量测定 真菌发酵液中紫杉醇的定量可采用薄层色谱(TLC) 、高效液相色谱( HPLC) 、UV 免疫分析、生物学方法和放射性前体标记等。 高效液相色谱( HPLC) HPLC 是最常用的、较为有效的分析检测方法。HPLC 不仅可以测定紫杉醇含量, 而且还能追踪分离紫杉醇。 色谱条件：惠普1100系列，采用XDB-C1