2019年环境中诱变物质的微核检测-山东大学.docVIP

山东大学实验报告 2014年 5 月 科目 遗传学实验 题目 环境中诱变物质的微核检测 第 PAGE 2 页 共 NUMPAGES 3 页 遗传学实验报告 环境中诱变物质的微核检测 摘要 微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构，是真核生物细胞核染色体发生畸变在间期细胞中的另一种表现形式。本实验用大蒜根尖作为实验材料，分别以清水和叠氮化钠溶液作为阴性对照和阳性对照，用咖啡对实验组根尖进行诱变。经改良苯酚品红染色、制片后观察统计各组的千分微核率，从而对咖啡的诱变作用进行分析。 引言 微核是间期细胞中在细胞核之外存在的一个或多个圆形或杏仁状结构，大小在主核的1/3以下，是有丝分裂后期丧失着丝粒的落后的染色体片段形成。微核是染色体畸变的一种表现方式。许多能引起染色体断裂的理化因素，如辐射、化学诱变剂等，均可作用于分裂细胞而产生微核。具体可分为： 物理因素：具有能量的各种射线，如α射线，β射线，γ射线，X-ray，中子，质子，UV等。 化学因素：诱变剂和重金属等。 经典断裂剂：Ｘ射线。 诱变剂：环磷酰胺、氧化铬CrO3、叠氮化钠NaN3、甲基璜酸乙酯EMS、硫酸二乙酯。? 目前研究表明，微核发生率同作用因子的剂量呈正相关，通过简单的微核技术可以反映诱变物质对生物的遗传危害。因此微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。 咖啡的主要成分为咖啡因。1980年美国食品药品管理局借动物实验观察表明, 咖啡因可以通过胎盘屏障, 引起胚胎畸形[1]。同时，据英国《独立报》报道, 世界卫生组织和联合国粮农组织最新的一项研究结果发现, 饮用咖啡的人平均每天摄入的致癌物质丙烯酞胺, 有三分之一来自烘烤的咖啡豆产生。人体大量摄入丙烯酞胺不但会影晌生殖系统功能, 还可致癌[2]。 为了研究咖啡是否真正具有诱变致癌作用，本次实验通过用咖啡进行大蒜诱变培养，在阴性和阳性对照设计下，计算其微核率，通过微核检测技术评价咖啡的诱变情况。 材料和方法 2.1 实验材料 材料：大蒜 培养皿、单面刀片、双面刀片、Eppendorf管、油性记号笔、显微镜、载玻片、盖玻片、镊子； 冰醋酸、无水乙醇、1M HCl溶液、100mmol/L NaN3溶液、雀巢速溶咖啡粉末，染液：改良苯酚品红。 2.2 实验方法 2.2.1 取材 选取生长良好、大小相对一致的大蒜，剥成一瓣瓣后置于放清水的培养皿中。在20℃左右的室温下浸泡约48h。选取根长约0.5-1cm的大蒜作为实验处理材料。 2.2.2 材料处理 将实验材料分为六组，放入8ml不同成分的培养液中，其中1组为阴性对照组，培养液为清水；2～4组为阳性对照组，培养液分别为25mmol/L、50mmol/L、75mmol/L NaN3溶液；5、6组培养液分别为2倍正常浓度的咖啡（0.52g/ml）和正常浓度的咖啡（0.26 g/ml）。将培养皿中置于20摄氏度左右室温下培养24h。 阴性对照组 阳性对照组 实验组 1组 2组 3组 4组 5组 6组 清水 25mmol/L NaN3 50mmol/L NaN3 75mmol/L NaN3 0.52g/ml咖啡 0.26g/ml咖啡 处理过后换用清水恢复培养24h，再将根尖切下，放在Eppendorf管中用卡诺氏固定液固定18h（少于24h）。最后转移到70%乙醇中放置在4℃保存。 （卡诺氏固定液的配制： 3乙醇∶1冰醋酸） 2.2.3 解离及染色 用1M HCl处理大蒜根尖材料10Min,使其组织解离开。再用水洗3次，洗去根尖表面的解离液。 切取近根尖分生区的伸长区组织，（根尖较白的区域及其上方约0.5cm左右）用改良苯酚品红溶液染色10Min。 2.2.4 压片 将染色后的材料盖上盖玻片，用一个双面刀片插到盖玻片和载玻片之间的一个小角，盖上两层吸水纸，用左手食指紧压盖玻片防止其滑动，用右手用解剖针针柄轻敲盖玻片，使材料均匀分散。在显微镜下观察细胞分散的便于观察时，用拇指垂直按压一下盖玻片。 2.2.5 镜检 先在低倍镜中找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察，找到微核。每个玻片选取一个或多个视野计数，统计含微核的细胞数和总细胞数，换算成微核千分率，然后取平均值。 结果 实验结果图 图1 含微核的细胞（10X40） 图2含微核的细胞（10X40） 图3 1组（10X40） 图4 2组（10X40） 图5 3组（10X40）