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第八章抗生素类药物的分析 一、效价的测定方法： 1、稀释法：原理：用液体培养基逐级将抗生素稀释，在各管中加入等量的试验菌液，进行培养，观察抑制细菌生长的最低抗生素浓度，再与同法测定的标准品终点作比较，从而求得被测抗生素的效价。 X=(T/S)*C X样品效价(U/ml) T检品液最大稀释倍数 S标准品液最大稀释倍数 C标准品液效价(U/ml) 检测终点判断 1、试验菌生长完全抑制 2、生长50%抑制 3、指示剂变色 4、电位差的改变 5、菌种的溶血现象等 2、比浊法 原理：将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养（约3-4h），测量培养基浊度，其浊度与细菌数、细菌群体质量存在直接关系，在一定的范围内符合比耳定律。 影响因素 物理因素:1、散射现象2、菌液浓度： 3、细菌体大小的变化 培养基：成分、酸度、培养温度、通气等条件影响。 金黄色葡萄球菌，pH在6.8-7.8。 培养：温度、振摇。 3、琼脂扩散法即管碟法 原理： 抗生素在涂布特定菌的琼脂培养基内扩散，形成一定浓度抗生素的球型区，抑制试验菌生长，通过透明培养基观察抑菌圈，抗生素剂量的对数与抑菌圈面积或直径成正比。在同样条件下将已知效价的标准品溶液与未知效价的供试品溶液的剂量反应(抑菌圈)进行比较； 当标准品和供试品是属于同一性质的抗生素时，标准品溶液和供试品溶液．对一定试验菌所得的剂量反应曲线，在一定剂量范围内应互相平行。根据以上原理，可设计为一剂量法、二剂量法及三剂量法。从而可以较为准确地测定供试品的效价 公式里各字母意义要记下。 影响抑菌圈半径的因素： （1）D的影响因素：抗生素本身结构、分子量等 杂质： 琼脂含量： 菌种对抗生素的吸附作用： pH影响分子的形式、 温度影响扩散 D增大，r也增大 （2）T的影响： 一般T增加，r增大。 （3）M的影响：在一定的范围内，小管内M越大，抑菌圈直径越大。 （4）C的影响：C越小，抑菌圈直径越大 （5）H的影响：培养基增厚，则抑菌圈减小。 操作步骤：1、 试验菌的纯化与悬液的制备 2 、缓冲液、灭菌水与培养基的制备 3 、标准品、供试品的称量、溶解与稀释 4 、双碟的制备及放管 5 、滴加药液 6 、恒温培养 7 、测量抑菌圈直径或面积 8 、计算 二、可靠性测验: 通过统计各组均数间的方差，以试品间、回归、剂间（列）、碟间（行）……的方差与误差项（S2）的比值（称F值），来确定各自差异的显著性程度和实验结果的可靠性。F值（F值=该项方差/误差项S2）可作为观察实验显著性程度的一个指标 试品间差异不显著（P0.05） 回归项非常显著（P0.01） 偏离平行不显著（P0.05） 剂间差异显著（P0.05） 碟间差异不显著（P0.05） 三、链霉素呈色反应: 1、茚三酮反应：蓝紫色化合物 2、坂口反应（sagaguchi test)：链霉素水解产物链霉胍特有。链霉胍，8-羟喹啉分别与次溴酸钠反应，其各自的产物在相互作用生成橙红色化合物。 3、糖类反应：莫利西反应(Molisch test)，五碳糖或六碳糖在硫酸存在的条件下脱水成羟甲基糠醛，与蒽酮显蓝色，与α-奈酚呈红紫色。 4、埃尔松-摩根（Elson-Morgan test)： 样品在强酸或强碱水解后释放出氨基己糖，在碱性条 件下与乙酰丙酮缩合，形成吡咯的衍生物，在碱性条件下与对二甲胺基苯甲醛的乙醇及盐酸溶液（Ehrlich试剂）成红色，在540nm处可定量测定。 5、麦芽酚反应(maltol test)： 链霉素在碱性溶液中水解，重排，生成麦芽酚在酸性溶液中与三价铁离子结合，形成紫红色络合物。 四、四环素类抗生素（了解） （一）呈色反应 1、浓硫酸反应 四环素 深紫色； 金霉素 蓝色至绿色； 土霉素 朱红色； 强力霉素 黄色； 2、三氯化铁反应：含有酚羟基，遇三氯化铁立即呈色反应， （二）荧光反应:土霉素绿色荧光，四环素黄色荧光 （三）紫外光谱 （四）色谱 五、大环内酯抗生素（了解） (一）呈色反应 1、硫酸反应：遇硫酸均呈红棕色 2、莫利西反应：糖类的反应 3、Seliwanaff 反应： 脱水 间苯二酚 糖 糖醛衍生物 具颜色产物 红霉素 淡黄色； 螺旋霉素 亮紫红色；