生物医学光子学_scy-3_共聚焦激光扫描(荧光)显微镜 20151125.pptVIP

激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 4. 由于点对点扫描去除了杂散光的影响  激光扫描共焦显微镜技术 三. 激光扫描共焦显微镜的设计特点: 1.点照明 2.具有照明pinhole和探测pinhole 3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面 4.具有扫描系统—— 逐点扫描成像 5.具有多个（四个） 荧光通道，可同时探测多个被标记物 激光扫描共焦显微镜技术 技术指标（Leica TCS SP2) : 1. xy分辨率比传统显微镜小1.4x 传统显微镜: Rxy=0.61?/NA （0.25 ?m ) Confocal: Rxy=0.4?/NA（0.18 ?m ) 2. 样品的最大厚度: 取决于: 物镜的NA、物镜的工作距离 激光的穿透力、样品的透明度 Z轴的最大移动范围(166?m、Z-wide) 3. 样品的最小光切厚度: (载物台最小移动距离为40nm） 取决于: 物镜的NA、针孔大小 Z轴的最小移动步距: 40nm Z轴的分辨率: 0.35 ?m 激光扫描共焦显微镜技术 4. 激光器 Ar激光器: 458nm, 476nm, 488nm, 514nm GreNe : 543nm; HeNe: 633nm Ar激光器(UV): 361nm 激光器的特点: 1) 方向性好: 激光基本延直线传播 2) 单色性好 :??=10-8nm 3) 高亮度: 激光方向性好, 其在空间上的能量分布是高度 集中的。 4) 偏振性: 激光为平面偏振光, 光纤耦合 激光扫描共焦显微镜技术 5. 四个荧光通道, 一个透射光通道 即除了可同时采集多标记荧光图像外 还可以同时采集透射光图像,但透射光 图像为非共焦图像。 * 共聚焦显微技术 激光扫描共焦显微镜技术 人眼分辨率： 0.2mm 光学显微镜分辨率：0.25mm 共焦显微镜分辨率：0.18mm 电子显微镜分辨率：0.2nm 共聚焦激光扫描（荧光）显微镜 　激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope LSCM)是20世纪80年代发展起来的一项具有划时代意义的高科技新产品，是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。 激光共聚焦显微镜利用激光作为光源，在传统光学显微镜基础上采用共轭聚焦的原理和装置，以及通过针孔的选择和PMT的收集，并带有一套对其所观察到的对象进行数字图像分析处理的系统软件。 与传统光学显微镜相比，它具有更高的分辨率，实现多重荧光的同时观察并可形成清晰的三维图象等优点。所以它问世以来在生物学的研究领域中得到了广泛应用。 Objective Arc Lamp Emission Filter Excitation Diaphragm Ocular Excitation Filter Objective Laser Emission Pinhole Excitation Pinhole PMT Emission Filter Excitation Filter Confocal Principle 照明针孔 探测针孔 二色镜或分光镜 激光光源 共聚焦显微镜的优点 减少由于光散射产生的图像模糊 增加有效分辨率 提高信噪比 厚标本的清楚细查 Z轴扫描 可以实现数字放大倍率的调节 激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 1.抑制图像的模糊，获得清晰的图像 激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 2. 具有更高的轴向分辨率，并可获取连续光学切片 conventional confocal 激光扫描共焦显微镜技术 共焦显微镜与传统显微镜的区别 3. 增加侧向分辨率  *