白僵菌分离及杀黄粉虫实验.doc

白僵菌的分离? PDA（马铃薯蔗糖）培养基的制备 白僵菌培养使用的培养基可使用PDA（马铃薯蔗糖）培养基，因为PDA培养基是一种被广泛用于培养酵母菌和真菌的半合成培养基，白僵菌是真菌杀虫剂，同样可以用这种培养基。 ①配方 马铃薯 200克 葡萄糖 20克 琼脂 15~20克 自来水 1000毫升 自然PH ②配制步骤 其做法是先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用纱布过滤，加热，再据实际实验需要加琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶， 加塞、包扎，（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。 \o 查看图片 ??煮马铃薯块 ③其他事项 1.培养基经灭菌后，必须放在37C温箱培养24h，无菌生长者方可使用。 2.PDA培养基一般不需要调pH。对于要调节pH的培养基，一般用pH试纸测定其pH。如果培养基偏酸或偏碱时，可用lmol/LNaOH或lmol/LHCL溶液进行调节。调节时应逐滴加入NaOH或HCl溶液，防止局部过酸或过碱破坏培养基成分。 3.培养基在使用时也可以做成不含琼脂的液体培养基，用于菌类的震荡培养。 4.培养基也可以加入氯霉素，加入量为0.1g/L培养基，主要是为了抑制细菌的生长，减少干扰性。 2）无菌水的制备? 分别向五个小三角瓶内加放100mL的蒸馏水；随后用棉塞和牛皮纸进行包扎，以备灭菌（121℃,20min）。 3）其他灭菌器才的准备? 将实验所需的搁置架/纱布/两套培养皿进行分别包扎后进行灭菌（121℃,20min）。 4）灭菌? ?准备就绪后利用手提式灭菌器进行灭菌（121℃,20min）。 5）白僵菌菌种的分离? 超净工作台和接种器具消毒器准备就绪后在酒精灯火焰附近将死去的虫体接种到培养基上进行培养。操作流程如下：? 利用无菌水清洗虫体三次→在培养皿内利用75%的酒精给虫体表面进行消毒→将虫体迅速转移到无菌水中进行再次清洗→用镊子将虫体安置到空的培养皿内→用刀子将虫体剪成两半→每四个虫体接种到同一个培养基上? ? 平板培养基上黄粉虫的形态 注（每次在用剪刀和镊子之前务必确保其温度不高，避免烫死虫体内部菌体被烫死；所接的虫体体段均匀安置在培养基表面，保证其拥有足够的生长环境）?5）培养? 将带有虫体的平板置于28~30℃的光照培养箱内进行培养，三天后观察结果。 6）实验结果? 大多数平板撒发出一股很难闻的臭味，虽没有污染杂菌但也没其他菌体生长。 白僵菌侵染黄粉虫实验 一．实验目的： 基本了解白僵菌的基本特征和侵染过程，并学习掌握白僵菌的毒力测定方法，比较不同白僵菌的不同浓度毒力大小。 实验原理： a分生孢子、附着在寄主的表皮上（7h）；b、分生孢子大量增殖，寄主组织逐渐解生，随后进入血腔，并在血腔内孢子萌发产生芽管和附着胞(22h)；c、菌体穿透到寄主表皮层中（28h），伴随着组织溶解（酶的机制），在穿透菌丝的附近，寄主表皮层的片层结构发生变形（机械性）；d、菌丝在表皮层内常平行于片层结构延伸，形成穿透菌丝；e、菌体从表皮层进入到皮细胞层中；f、在寄主死体内产生有活力的孢子，并可再侵染 。 实验方法：采用浸渍法 四、实验器材与试剂 1、实验用具： 灭菌培养皿、灭菌滤纸、无菌水、灭菌试管、灭菌镊子、微量移液枪、显微镜、恒温培养箱。 2、 实验材料： 白僵菌 （Beauveria bassiana ）Bb-10-12 、成品白僵菌、黄粉虫、0.1%吐温80湿润剂的0.003 mol/L KH2PO4缓冲液 五、实验步骤 1、将-4℃保存的白僵菌25±1℃、相对湿度80%±10%下用PDA培养基（马铃薯蔗糖培养基）扩繁培养 2、带完全产孢后，用含0.1%吐温80湿润剂的0.003 mol/L KH2PO4缓冲液将分生孢子粉湿润、洗脱，磁力搅拌器搅拌混匀，并用五层灭菌纱布过滤，除去菌丝和杂质。 3、用血球计数板在显微镜下计数孢子数，测出其浓度，再用无菌水分别稀释成孢子浓度梯度为109、108个/mL的悬浮液备用。 4、采用浸渍法将黄粉虫虫体浸入孢子悬浮液中1秒，对照组浸渍无菌水处理。 5、浸渍后放于灭菌滤纸上爬行尽快吸干其身上多余的悬浮液，吸干后把试虫放入培养皿中，（25±1）℃、相对湿度80%±10%饲养。 6、每种试剂两个处理浓度，每个处理浓度3个重复，每个重复使用5条虫子 7、施药后每1d记录一次死虫数，连续调查5次。将死虫挑出保湿培养，记录僵虫数。 8、结果统计 毒力结果记录表 药剂 浓度（个孢子/mL） 试虫数(头) 施药后3天 施药后6天 施药后9天 施药后12天 施药后15天 死亡率（%） 校正死亡率（%） 死亡率（%）