第14章基因重组和基因工程解读汇编.pptVIP

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering DNA 研究史 1865年 G.Mendel的豌豆杂交实验，提出遗传因子概念，并总结出孟德尔遗传定律 。 1868年 Miescher.从脓细胞中提取“核素” 1909年丹麦植物学家和遗传学家约翰逊首次提出“基因”这一名词，用以表达Mendel的遗传因子概念。 1944年O.T Avery等的肺炎球菌转化实验，说明DNA是遗传物质。 /experiment/430/590/597/19370.htm 1953年Watson和Crick.发现DNA双螺旋结 构。具有划时代的意义。 DNA克隆、测序与重组技术的历史 近十几年来，出现转基因技术、基因剔除技 术、核转移技术 （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （四）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 （一）目的基因的获取 化学合成法 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) Holliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐； 　 　 复习思考题： 　1. 概念： （1）克隆 （2）转化 （3）基因工程（4）限制性核酸内切酶 （5）载体 （6）G文库 （7）质粒 （8）c文库 2. 简述基因工程的基本过程。 3. 简述目的基因的主要来源或途径。 可接合质粒如 F 因子(F factor) 细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。 质粒 （二）转化作用 通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用 (transformation)。 例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。 （三）转导作用 当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。 λ噬菌体的生活史 溶菌生长途径 (lysis pathway) 溶源菌生长途径 (lysogenic pathway) 三、位点特异重组，即特异位点间发生的整合 位点特异重组(site-specific recombination) 是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合；反转录病毒整合酶可特异地识别、整合反转录病毒cDNA的长末端重复序列(long terminal repeat, LTR)。 （一）λ噬菌体DNA的整合 （二）细菌的特异位点重组 沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。 hix为反向重复序列，它们之间的H片段可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基因表达，另一正向时驱动H2和rH1基因表达，反向(倒位)时H2和rH1不表达。rH1为H1的阻遏蛋白基因。 H2鞭毛素 阻遏蛋白 Hin重组酶 转位片段 hin H2 I H1 H1鞭毛素 hin H2 I DNA 启动序列 H1 启动序列 沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变 （三）免疫球蛋白基因的重排 免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(?和?)，一个编码重链。 轻链的基因片段： 重链的基因片段： L V J C L V D J C 重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombination signal sequen