酵母文库筛选-Mating篇.docVIP

Mating筛库 1.在做文库筛选前，首先需要检测你的诱饵的自激活活性和对酵母的毒性。 以用诱饵PGBKT7-X来筛选构建在PGADT7载体上的文库（Y187菌）为例。 将PGBKT7-X和PGBKT7空载转入AH109酵母菌，将PGADT7空载转入Y187酵母菌（也可以取少量你的文库菌）。将含PGBKT7-X/PGBKT7的AH109与含PGADT7的Y187融合（方法见下文）。融合好的菌涂布以下平板(也可以同时稀释10倍涂布一套板，一缺多涂一个稀释100倍和1000倍的)： 一缺SD –L, 一缺SD –W,二缺SD -L-W, 三缺SD -L-W-H，三缺SD -L-W-H +3AT(1 mM, 2 mM, 5mM),四缺SD -L-W-H-ade。 放30℃，培养3-5天。你应该时不时去观察一下，不要等长3天才去看。首先你可以根据一缺和二缺长的斑数目，计算出融合效率。根据各种三缺的生长情况来选择筛选文库的条件，适合筛选文库的三缺板应当比二缺的斑少很多或者没有斑，同时斑应该长得很小（放5天）。如果自激活强，各三缺全长，那么可以考虑用四缺和四缺加3AT去筛选，也可换载体或者把基因截断筛选。 酵母的毒性检测很简单，把PGBKT7-X和PGBKT7空载转入AH109酵母菌，涂布一缺，如果你的蛋白有毒性那么转PGBKT7-X的菌比PGBKT7的菌小很多，但不要涂得太密了，可以稀释10倍和100倍涂。 2.诱饵活化 a．将含PGBKT7-X的酵母单克隆点在一缺平板上，可以点多个菌斑，30℃ b.挑取几个菌斑于50ml SD –W液体培养基（500ml三角瓶），30℃ 220rpm 16-20h，OD600 达到0.8 c．12000rpm 离心30秒，收集菌。 d．用5ml SD –W液体培养基重悬菌体，使1ml菌中细胞数达到108以上。可以用细胞计数板数（稀释适当倍数）。 3.融合 a．取一管1ml/管文库菌放冰上解冻。取10ul出来稀释后，涂SD –L平板（梯度稀释），同时用计数板计算细胞数。1ml文库菌细胞数应该大于2x107。不够的话，可以放2ml文库（这一步一般在文库扩繁时有记录，再测一遍是为了看菌从-70 b．将5ml诱饵菌和1ml文库菌加入2L的三角瓶中,管子可用2xYPDA冲洗后并入瓶中。 c．往三角瓶里面加入45ml的2xYPDA，加kan 50ug/ml。 d．30℃ 4．摇20h后，取小量融合的菌，用显微镜观察融合情况。多数细胞成三叶草型（如下图），表明融合好了。如果没有，就再融合4个小时。 5. 10000g离心 10 min收集菌，用0.5xYPDA洗瓶子收集残余的菌，并用0.5xYPDA洗涤沉菌一次。 6.加入10ml 0.5xYPDA（用无菌水也可以），这样总体积大概12-15 ml。 7.取小量稀释10,100,1000倍，分别涂-L,-W,-L-W平板，计算融合效率和筛选的总菌数。 8. 200ul/板涂150mmSD平板（这第1步中确定的适当筛选条件）50-60个（菌多的话多涂点板子），30 9.一般长2天可以进行观察，一天看2次，阳性菌会长得又快又大，用记号笔做好标记。 注意： 1. AH109(MATa), Y187(MATα)两菌能融合。 2. 2xYPDA 指YPDA各组分加倍， 0.5xYPDA 指YPDA各组分减半。 3. 液体和固体培养基全部加50 ug/ml 的卡那霉素。 4. 用PGBKT7载体筛选文库，因这载体为kan抗性和文库质粒的AMP抗性不一样，便于后续的文库测序验证。 5. 筛选的条件很关键，有时需要根据自己的诱饵去摸索。 文库扩繁 取0.5 ml文库菌，加入20-30ml YPDA液体培养基，200ml瓶子。 30℃ 200 rpm 培养2 h 200ul-300ul/板 涂100个150 mm YPAD固体平板。 30℃ 用YPDA液体培养基将平板上的菌洗入大瓶中。 12000rpm 1min收集菌。 用YPDA液体培养基洗涤沉菌一次。 根据菌的多少加入适量的Freezing Medium YPDA（约100ml）。 用计数板数细胞数，同时测OD600,使最终达到5 OD/ml左右，酿酒酵母1ml 1OD的菌大概1-2x107个细胞。 1ml/管快速分装，放-70 Freezing Medium YPDA： Mix 100 ml YPDA (sterile) and 50 ml 75% 甘油(sterile). 注意： 文库扩繁以后难免降低库容量，提高mating效率很关键。 文库扩繁时各培养基必须加入50ug/ml的kan。 每步必须进行严格的无菌操作，如果发现长杂菌的板子果断扔掉。 大家在试验过程中发现的问题可以补充进来，使我们的方法更加完善。