重点实验室protocol-CWF全长cDNA文库构建流程(1).doc

农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室 全长cDNA文库构建操作流程v1.0 赵光耀2007.3整理 PAGE PAGE 1 Full-length cDNA文库构建流程 一、第一链cDNA的合成 1.1. mRNA 10ul（大约20ug） 100uM oligo(dT) primer 1ul (引物序列及使用方法在最后) 混合，离心，65℃水浴5分钟，置于冰上。 1.2. RT PCR（为保险起见，可扩大体系到100ul，mRNA量不少于20ug） （保证总体积100ul不变，可以根据情况变动mRNA和水的体积） RNA+Primer 11.5ul 5×buffer 10ul 10mM dNTPs 2ul (其中的dCTP为m5dCTP) 0.1M DTT 4ul RI（RNase Inhibitor） 1ul SSII RT 2ul DEPC-H2O 19.5ul 总计 50ul PCR程序 1= 40.0°C for 1:00 2=40.0°C for 10:00 3=45.0°C for 10:00 4=50.0°C for 2:00 5=GOTO 2, 4 times 6=4.0°C forever 7=end 1.3. 加25ul苯酚和25ul 氯仿，13000转离心10分钟，取上清液 1.4. 向上清夜中加5ul 3M NaAc和150ul 无水乙醇，-20℃过夜。 (*注意:此步骤的酚氯仿抽提可以去掉,以减少损失) 二、氧化CAP结构和加Biotin 2.1. 13000转4℃离心30分钟； 2.2. DEPC-75%乙醇离心10分钟，洗两次，干燥并溶于40ul DEPC-H20中； 2.3. 40ul RNA/cDNA 5ul 660mM NaAc pH=4.5 5ul 50mM NaIO4 用铝箔包埋于冰中45分钟； 2.4. 加5ul 5M LiCL 1ul 10% SDS 56ul 异丙醇 -20℃放置1小时； 2.5. 13000转离心1小时； 2.6. 50ul DEPPC-75%乙醇离心10分钟，洗两次，干燥后溶于50ulDEPC-H2O； 2.7. 50ul RNA/cDNA 5ul 1M NaAc pH=6.1 5ul 10% SDS 150ul 10mM biotin 室温(22-26℃)过夜。 三、筛选全长cDNA 加 5ul 5M NaCl 75ul 1M NaAc pH=6.1 750ul 无水乙醇 放置于冰上至少1小时或者－20℃更长时间(可以过夜)。 13000转离心30分钟； EDPC-75%乙醇离心10分钟，洗两次，干燥并溶于40ul DEPC-H2O中； 加 10×Rnase buffer 5ul Rnase = 1 \* ROMAN I 5ul 37℃保温30分钟 (全长筛选过程我们为使用dynal的磁珠，按说明书进行即可，注意按照RNA操作方法进行) 准备磁珠 = 1 \* GB3 ①将磁珠充分混匀，取出600ul Dynal磁珠到一个DEPC处理的1.5ml离心管中,放在磁架上，静置至少2分钟，弃上清液；加入600ul solution A,充分混匀,放在磁架上,经置至少1分钟,取出上清;重复一次;加入Solution B 600ul,充分混匀 = 2 \* GB3 ②加400ul 1×B/W buffer ,15ul 10mg/ml tRNA; = 3 \* GB3 ③放在冰上，经常混合，30分钟； = 4 \* GB3 ④在磁架上静置至少2分钟，弃上清液； = 5 \* GB3 ⑤加600ul 1×B/W buffer，混匀，静置，分离，弃上清液。重复4次。 = 6 \* GB3 ⑥将磁珠溶在300ul 1×B/W buffer中，备用。 将50ul RNA/cDNA 与 300ul 磁珠混合，室温混匀30分钟；(可以放在杂交炉内) 用磁架分离MPG（RNA/cDNA）和溶液(截短的cDNA片段),弃上清； 用600ul 1×B/W buffer洗涤带有RNA/cDNA的磁珠 4次； 向带有RNA/cD