基因工程-第2章-基因工程的工具酶.pptVIP

同尾酶(isocaudamer)是与同裂酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别的靶序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。常用的限制酶BamHⅠ，BclⅠ，Bgl Ⅰ,Sau Ⅱ 3AⅠ,和XhoⅡ就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC 4个核苷酸组成的粘性末端。 酶的星号活性 迄今发表的第二类限制性内切酶的识别序列都是在一定消化条件下测出的。当条件改变时，酶的专一性可能会降低，以至同一种酶可识别和切割更多的位点。如EcoR I通常只能识别GAATTC，但在低盐(50mmol／L)，高pH(8)和甘油存在的情况下，产生了活性改变的EcoR I*，称为EcoRⅠ的星号活性。通常除了中间四聚体的T不能变为A或A不能变为T以外，识别序列的6个碱基位置上仅在一处与原来序列不同的任何一种碱基的替代，EcoR I*照样能识别此序列，如GAATTA，AAATTC和GAGTTC等。因而EcoR I*识别序列在DNA出现的频率要比EcoR I识别序列出现的频率高15倍。 除了EcoR I* 以外，还发现BamHⅠ也有类似情况。用BamHⅠ*表示这种活性变化的酶。从上述例子看出，只有在相当特殊的反应条件下，酶的活性才与发表的结果相符，pH或离子状况的改变直接影响酶的活性。为了得到一种限制性内切酶的最适反应速度和理想的消化专一性，必须坚持应用推荐的反应条件。 限制性核酸内切酶的命名 由于发现的限制性核酸内切酶越来越多，所以需要有一个统一的命名规则。H.O.Smith和D.Nathans于1973年提议的命名系统已被广大学者所接受。他们提议的命名原则包括以下几点： ①用细菌属名的第一个宇母和种名的头两个字母，组成三个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。 ②用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型，例如Ecok。如果限制与修饰体系在遗传上是由病毒或质粒引起的，则在缩写的寄主菌的种名右下方附加一个标注字母，表示此染色体外成分，例如Ecopl，EcoRl。 ③如果一个特殊的寄主菌株具有几个不同的限制与修饰体系，则用罗马数字表示。因此，流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindⅠ,HindⅡ,Hind Ⅲ 等等。 ④所有的限制内切酶，除了总的名称核酸内切酶R外，还带有系统的名称，例如核酸内切酶R. Hind Ⅲ。同样地，修饰酶则在它的系统名称前加上甲基化酶M的名称。因此，相应于核酸内切酶R. Hind Ⅲ 的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. Hind Ⅲ。 由于以上命名规则比较繁琐，所以在实际应用上这个命名体系已经作了进一步的简化： （1）由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以现在通行的是把所有略语字母写成一行。 （2）在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方，核酸内切酶的名称R便被省去。 3.核酸内切限制酶对真核生物基因组的消化作用 小分子量的片断-----少 （电泳-容易分离目的片断） 大分子量的片断-----多（基因文库） 二、ＤＮＡ连接酶（DNA ligase） 末端核苷酸转移酶（terminal transferase） 该酶全称为末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），它是从小牛胸腺中纯化出来的一种小分子量的碱性蛋白质，在二甲胂酸缓冲液中，能催化5’脱氧核苷三磷酸进行5’－3’方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线性DNA分子的3’-OH末端。 它不需要模板，可以用含有的3’-OHＤＮＡ片段为引物，在3’-OH端加入核苷酸达几百个。 它作用的底物可以是具有3’-OH末端的单链DNA,也可以是具有3’-OH突出末端的双链DNA 用途： 1. 催化[α-32P]-3’-脱氧核苷酸标记DNA片断的3’ 末端。可用于测序的终止，一位不含游离的3’-OH末端。 2. 催化非放射性的标记物掺入到DNA片断的3’-末端： 生物素等，掺入后可产生荧光染料或抗生物素蛋白结合物的接受位点。 3. 用于在平头ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，从而形成粘性末端。 碱性磷酸酶： 来自于大肠杆菌（bacterial alkaline phosphatase BAP）或小牛肠（calf intestinal alkaline phosphatase CIP），该酶用于脱去DNA（RNA）5’末端的磷酸根，使5’-P成为5’-OH，该过程称核酸分子的脱磷酸作用。当需要5’端同位素标记或为了避免DNA片段自身