hplcfinal高效液相色谱分析.pptVIP

液相色谱仪器 * 高效液相色谱是在气相色谱和经典色谱的基础上发展起来的。现代液相色谱和经典液相色谱没有本质的区别。 不同点仅是现代液相色谱比经典液相色谱有较高的效率 和实现了自动化 操作。 高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。 一、概述 HPLC的特点 特点：高压、高速、高效、高灵敏度 高沸点、热不稳定的有机及生化试样的高效分离分析方法。 二、高效液相色谱法的特点 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 高效液相色谱法的基本概念及理论基础，如保留值、分配系数、分配比、分离度、塔板理论、速率理论等与气相色谱法是一致的。而两者的主要区别可归结于流动相的不同。 高效液相色谱的流动相为液体，而气相色谱的流动相为气体。 液体的扩散系数只有气体的万分之一至十万分之一；液体的粘度比气体大一百倍，而密度为气体的一千倍。这些差别将对色谱过程产生影响。 1. 涡流扩散项He 与气相色谱相同。 2 . 纵向（分子）扩散项 Hd 式中：Cd为一常数；Dm为分子在流动相中的扩散系数。 高效液相色谱中的速率方程式 由于分子在液体中的扩散系数比气体中小4~5个数量级，因此在液相色谱中，当流动相的线速度大于0.5 cm/s时，纵向扩散项对色谱峰的扩展的影响可以忽略。而气相色谱中这一项却是重要的。 3. 传质阻力项 （1）固定相传质阻力：发生在液-液分配色谱中。 式中： Cs是与容量因子有关的常数； Ds是试样分子在固定液内的扩散系数； df是固定液膜的厚度。 固定相传质：试样分子从流动相进入到固定液内进行质量交换的传质过程 （2）流动相传质阻力 a. 流动的流动项中的传质阻力项 Hm 式中： Cm是一个与容量因子有关的常数，其值取决于柱直径、形状和填充的填料结构。当柱填料规则排列并紧密填充时， Cm降低。 dp为固定相粒度； Dm是试样分子在流动相中的扩散系数。 b. 滞留的流动项中的传质阻力项 Hsm 式中Csm是一与颗粒微孔中被流动相所占据部分的分数及容量因子有关的常数。 高效液相色谱中的速率方程式为： 简写为： 与气相色谱的速率方程式一致，其主要区别在于纵向(分子)扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。 GC的H-u曲线是一条抛物线，有一个最低点（最佳流速）；HPLC的H-u曲线是一条斜率不大的直线，这表示分子扩散项对H基本上没有影响，这也说明HPLC分离可以在高的流动相流速下而不至于使柱效损失太多，从而可以实现快速分离。 在高效液相色谱中, 液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/u较小，可以忽略不计，即： H = A + C u 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同。 液体的粘度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。 讨论——影响分离的因素与提高柱效的途径 由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。 液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。 改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。 1. 固定相粒度 2.流速 流速大于0.5 cm/s时, H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。 3.固定相及分离柱 气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。 但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。 固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相间的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。 C-18柱（反相柱）。 HPLC的主要类型及其分离原理 一、 液-液分配色谱 固定相：为固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离