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无菌检查医疗课件 一、无菌检查 环境保证 培养基保证 有效的方法 SOP操作 有效的结果 无菌性检查 灵敏度检查 方法确认 可靠的结论 结果判断 二、检测标准 《中华人民共和国药典》2015版 四部 1101 无菌检查法 GB/T 14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法 ISO 11737-2 2009 医疗设备的灭菌－微生物学方法 第二部分：灭菌过程中无菌测试的定义，验证及维护 三、检测环境 2015版药典要求 1101 无菌检查：无菌检查应在无菌条件下进行，试验环境必须达到无菌检查的要求。 9203 药品微生物实验室质量管理指导原则：无菌检査应在B级背景下的A 级单向流洁净区域或隔离系统中进行， 单向流空气 、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 GB/T 14233.2-2005：无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。 四、菌种的选择 菌株名称及编号 菌种分类 无菌检查适用性 培养基查适用性 金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003 革兰氏阳性菌 ✔ ✔ 大肠埃希菌CMCC(B)44102 革兰氏阴性菌、对抑菌性敏感 ✔ × 铜绿假单胞菌CMCC(B)10104 革兰氏阴性菌、对营养物质要求高 × ✔ 生孢梭菌CMCC(B)64941 厌氧菌 ✔ ✔ 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 芽孢杆菌 ✔ ✔ 白色念珠菌CMCC(F)98001 酵母菌 ✔ ✔ 黑曲霉CMCC(F)98003 霉菌 ✔ ✔ 注：菌株传代次数不得超过5次。 五、实验材料准备 1、实验所需的培养基及稀释液（2015版药典） ①胰酪大豆胨液体培养基——用于真菌和需氧菌的培养 ②流乙醇酸盐流体培养基——用于厌氧菌的培养，也可用于需氧菌培养。 ③胰酪大豆胨琼脂培养基——用于细菌的计数 ④沙氏葡萄糖琼脂培养基——用于霉菌的计数 五、实验材料准备 2、培养基配制 ①直接购买配制好的干粉培养基，按照培养基包装上的说明，取规定量的干粉培养基及纯化水进行配制，按121℃，15min进行灭菌，灭菌后冷却至室温备用。 ②药典规定：配制好的培养基应保存在2~25℃，非密闭容器，一般三周以内使用。 五、实验材料准备 3、培养基适用性检查 ①无菌性检查——排出培养基本身的污染，避免无菌试验过程中由培养基引起的假阳性 ②灵敏度检查——确保培养基营养性良好，对微生物具有生长促进作用，排出无菌试验过程中由培养基引起的假阴性 注：用于无菌检查的培养基必须经过培养基适用性检查。 五、实验材料准备 3、培养基适用性检查 培养基 菌株 数量 菌量 培养 FTM(12ml) 金葡 2 ＜100cfu/ml 30~35℃3天 铜绿 2 生孢 2 阴性 1 / 无菌性 5 / 30~35℃14天 TSB（9ml） 枯草 2 ＜100cfu/ml 20~25℃5天 白念 2 黑曲霉 2 阴性 1 / 无菌性 5 / 20~25℃14天 五、实验材料准备 4、其他实验材料 ①带滤芯枪头 ②量筒（100ml） ③剪刀、镊子 ④无尘布 以上物品可采样湿热灭菌121℃，30min 。 六、实验设备 1、电子天平——用于培养基干粉的称量 2、压力蒸汽灭菌器——用以培养基及实验物品的灭菌 3、生化培养箱——用于细菌的培养 4、霉菌培养箱——用于霉菌及酵母菌的培养 5、生物安全柜——用于实验环境的提供 七、菌液的制备 菌株的准备：取1瓶复溶液和1瓶定量菌株，平衡至室温。在生物安全柜内，撕开菌株瓶的铝塑组合盖，在无菌操作下，取镊子过火焰灭菌后，待其冷却，用镊子打开菌株瓶的冻干塞，打开复溶液的螺旋盖并把菌株冻干粉倒入复溶液中，重新旋紧螺旋盖并漩涡震荡至少10秒确保菌株完全溶解，即得所需菌悬液（每0.1mL的菌悬液即含10~99cfu）。 八、验证方法 目的：确认无菌试验的产品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被证实。 无菌检查方法有直接培养法和薄膜过滤法两种。 医疗器械最常使用的方法为直接培养法，薄膜过滤法适用于液体类产品或供试品已转化为供试液的产品，本公司的产品制备成供试液后仍有颗粒杂质无法过滤，故选用直接培养法。 八、验证方法——直接培养法 培养基 菌株 菌量 供试品 组别 培养 流乙醇酸盐流体培养基 金葡 ＜100cfu/ml √ 试验组 30~35℃不得超过5天 金葡 —— 阳性对照组 大肠 √ 试验组 大肠 —— 阳性对照组 生孢 √ 试验组 生孢 —— 阳性对照组 胰酪大豆胨液体培养基 枯草 √ 试验组 20~25℃不得超过5天 枯草 —— 阳性对照组 白念