第三章高效液相色谱.pptVIP

仪器组成 溶剂贮液瓶 用途：贮存流动相溶剂 材料：玻璃或塑料，无色或棕色， 容积：约为0.5～2.0L 位置：高于泵，以保一定的输液静压差。 高压输液泵 是HPLC系统中最重要的部件之一。 输液泵的性能好坏直接影响到整个系统的质量和分析结果的可靠性。 输液泵应具备的性能 ①流量稳定。对定性定量的准确性至关重要。 ②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范围内连续可调，制备型能达到100ml/min。 ③输出压力高，一般可高达400~500 kg/cm2。 ④液缸容积小，适于梯度洗脱。 ⑤密封性好，耐腐蚀。 输液泵类型 1 螺旋注射泵 2 往复柱塞泵 3 往复隔膜泵 4 气动放大泵 泵的使用与维护 防止任何固体微粒进入泵体，因此应过滤流动相。 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应停泵过夜或保留在泵内更长时间。必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于保存色谱柱和有利于泵维护的溶剂。 2.脱气装置 流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。小气泡慢慢聚集后会变成大气泡，大气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。气泡一旦进入色谱柱,排出这些气泡则很费时间。在荧光检测中,溶解氧还会使荧光淬灭。溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。 4.进样系统 作用：将试样引入色谱柱 位置：在高压泵和色谱柱之间 类型：手动或自动 进样器：六通阀 进样器 手动 经注射器进样 自动 六通阀 圆盘式自动进样器 链式自动进样器 六通阀手动进样器原理示意图 手动进样器 用微量注射器将样品溶液注入六通阀 注意必须使用HPLC专用平头微量注射器，不能使用气相色谱尖头微量注射器，否则会损坏六通阀。 进样方式：有部分装液法和完全装液法 自动进样器 由计算机自动控制进样六通阀、计量泵和进样针的位置，按预先编制的进样操作程序工作，自动完成定量取样、洗针、进样、复位等过程。 5 . 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。 柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。 柱温箱 用于使色谱柱恒温的装置，一般其控温范围高于室温，也可低于室温，通常控制柱温在30～40℃。有些柱温箱还具有柱切换装置。 色谱柱的工作温度对保留时间、相对保留时间、溶剂的溶解能力、色谱柱的性能、流动相的粘度都有影响。一般升高柱温，可增加组分在流动相中的溶解度，减小分配系数K，缩短分析时间；还可降低流动相的黏度，降低柱压与提高柱效。 HPLC分析基本操作 1．准备：流动相配制、脱气，样品制备。 2．开机：依次打开计算机、泵、检测器、柱温箱电源开关，仪器自检。 3．装柱：将吸液头插入已经过滤和脱气处理的甲醇中，开启泵，使液体流出，调流速在0.2mL/min，连接色谱柱（注意方向），待液体流出色谱柱后，再与检测器连接。 HPLC分析基本操作 6．待基线走稳后，进样分析，采集图谱。 7．建立数据处理方法，选择峰宽、积分阈值、处理区间、指定最小峰面积和峰高等；处理色谱图，记录色谱信息 （色谱峰面积）。 8．冲洗 全部测定完毕后，冲洗色谱柱和管路（调节溶剂洗脱强度从小到大冲洗柱子）。 仪器使用注意事项 1．HPLC分析所用水均需纯化处理，用新鲜二次蒸馏水或蒸馏水经脱离子处理。 2．流动相需经过滤、脱气后方可使用。样品需经过滤或高速离心后方可进样分析。 3．做完实验后，反相色谱柱需用甲醇冲洗20~30 min。若流动相中含盐类或缓冲溶液，应先配制相同比例的无盐流动相冲洗，逐渐变化到95%水溶液冲洗，再逐渐变化到用甲醇冲洗，以保护色谱柱和高压输液泵。 目前应用最多的是柱塞往复泵。 防止流动相耗尽空泵运转，导致柱塞磨损、缸体或密封损 坏，最终产生漏液。 输液泵的工作压力不能超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液(40 MPa, 400 bar, 5800 psi)。 流动相应脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。 目前，液相色谱流动相脱气使用较多的是：①离线超声波振荡脱气； ②