ch17 基因工程教学课件.ppt

* * * * * * * * * * 目的基因的获取 化学合成法 基因组文库筛选法 cDNA文库筛选法 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR） 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。 基因组文库（genomic library） genomic library cDNA文库（cDNA library） 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有由mRNA逆转录而来的cDNA的集合。 Reverse transcription 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR） by Kary Mullis in 1983. simple, specific and potent. template DNA, primers, TaqE, dNTP etc. ①denature ②annealing ③extension PCR反应原理 PCR引入酶切位点 基因载体 基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子。 载体的选择条件： 能自主复制。 具有两个以上的遗传标记，便于重组体的筛选和鉴定。 有多克隆位点，即多个单一酶切位点。 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 常用载体： 质粒（plasmid） 噬菌体（bacteriophage） 科斯质粒（cosmid vector） 细菌人工染色体（bacterial artifitial chromosome） 酵母人工染色体（yeast artifitial chromosome） 病毒改造载体（植物病毒、动物病毒） 质粒（Plasmid） 质粒是存在于细菌染色体之外、能独立自主复制的小型环状双链DNA分子。常带有某些遗传信息，赋予宿主细胞一些遗传特性，如抗生素抗性、重金属抗性等。 pBR322 4363bp Polylinker MCS: multiple cloning site Promega polylinker-an insert with multiple restriction sites or multiple cloning sites(MCSs) 噬菌体（ Bacteriophage） 噬菌体是侵染细菌的病毒。利用噬菌体侵染细菌的生活特性将噬菌体改装为载体。 Bacteriophage cloning vector 一般分为： 克隆载体（cloning vector）：目的是使插入的外源DNA序列扩增的载体。 克隆载体带有一些利于扩增的元件，如松弛型的复制起点等等。 表达载体（expression vector）：目的是使插入的外源DNA序列转录翻译为多肽链的载体。 表达载体常带有一些利于表达或纯化的元件，如强启动子、翻译调控序列、报告基因、融合基因等等。分为原核表达载体和真核表达载体。 原核表达载体主要组成元件示意图 Invitrogen 真核表达载体示例 常用方法有： 抗药性标记选择，如插入失活法； 标志互补，如α互补； 分子杂交法，如原位杂交、Southern印迹 重组体的筛选 插入失活法筛选示意图 α互补筛选示意图 原位杂交 Southern印迹 克隆基因的表达 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的选择 表达产物的分离纯化 原核表达体系 以E.coli为代表 优点：培养简单、迅速、经济，适合大规模生产工艺，遗传背景清楚。 缺点：不能表达真核基因组DNA；不能加工真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体，难获得大量可溶性蛋白。 真核表达体系 常用酵母、昆虫、哺乳动物细胞。 优点：能表达真核基因组DNA和cDNA；能适当修饰表达的蛋白质；表达产物分区域积累。 缺点：操作技术难、费时、成本高。 2.3 重组DNA技术的应用 动植物品种改良 基因诊断 基因治疗 疾病基因的发现 基因工程制药 复 习 名词解释： DNA克隆 基因组文库 cDNA文库 生物技术工程由哪些学科组成？ II类限制性内切酶的特点。 克隆载体具有哪些特征？ 原核表达体系和真核表达体系各有哪些优缺点？ * Genetic recombination and genetic engineering基因重组和基因工程 1. 自然界的基因转移和重组 接合作用（conjugation） 转化作用（transformation） 转导作用（t