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荧光探针医疗讲义 01 分光光度法 灵敏度较低 02 电化学法 选择性较差 03 原子吸收 光谱法 对仪器要求 较 高、分析 成本高 04 高效液相色谱法 对仪器要求较高、分析成本高 05 荧光光谱法 简便、快捷灵敏度高、选择性好、 成本低等优点 研究背景 常见的检测方法 01 研究背景 02 检测原理 03 实验部分 04 实验结论 Contents 目 录 Cu2 + 生物体中基本的微量元素一; 生物体内过量摄入的铜也会产生毒性; 采用荧光探针的方法检测铜离子，尤其是跟踪其在化学反应和生命活动中的作用过程具有重要的意义． 研究背景 Cu2 + 背景知识---荧光探针 典型的荧光探针由识别基团(受体)，荧光团和连接二者的连接基团所组成。受体和底物结合后,导致受体分子光物理性质的变化,具体表现为荧光团部分发生突光猝灭或增强。 检测原理 背景知识---荧光探针的机理 ?顺磁性荧光猝灭 ?光诱导电子转移机理 ?光诱导电荷转移机理 ?荧光共振能量传递 ?激基缔合物或激基络合物的形成 检测原理 顺磁性突光猝灭---猝灭型荧光探针 Cu2+是d9结构的顺磁性离子，荧光团系统内交叉能量传递(isc)速度更快， 促进了体系间跨越，使得激发单重态的荧光分子转变至三重态，这是 荧光猝灭的主要原因，对荧光具有极强的猝灭。 大多数报道的铜离子荧光分子探针都是荧光猝灭型的。探针识别客 体时荧光猝灭不仅不利于高通量信号输出，而且其它猝灭过程也易引起 干扰，所以开发高灵敏、高选择性的荧光增强型铜离子荧光分子探针具 有重要意义。 检测原理 原理：识别基团很强的给电子能力，能够将其处于最高占有轨道(HOMO)上的电子,转入激发态的荧光团因电子激发而空出的HOMO，从而使突光团被光激发的电子无法直接跃迁回基态轨道发出突光,从而导致突光团辞灭；但是当识别基团与被识别客体相结合后,识别基团的给电子能力降低，使受体的HOMO低于荧光团的HOMO，导致PET过程减弱,或不再发生,突光团能够放出荧光。 检测原理 光诱导电子转移机理(PET过程)---荧光增强 “turn －on”类型 实验部分 Cu2+浓度逐渐增大，RA的荧光强度大幅度增加，最大发射波长由565 nm红移到571 nm，也证明了探针分子发生了开环，形成了共轭体系较大的荧光体系。 测定荧光光谱 一、时间对RA和Cu2+反应的影响 可以看出，反应刚开始时体系荧光增强的速率较快，但1 h后荧光增强的速率变慢,，2 h后荧光强度变化很小，几乎形成了一个平台，说明RA和Cu2+的反应基本完成。 本文选择RA和Cu2+反应2 h后进行测试。 实验部分 二、溶剂体系对RA和Cu2+反应的影响 实验部分 可见，纯水或在纯乙腈中，Cu2+和探针RA之间相互作用不明显，体系的荧光强度很弱。当CH3CN/H2O的体积比在1B9~9B1之间时，探针RA可对Cu2+进行很好地识别。其中，CH3CN/H2O的体积比为1：1时，荧光强度已接近最大；再增加乙腈的含量，虽然体系的荧光强度未降低，但增加有机试剂的用量对环境和生物体系的测试均不利，因此选择V(CH3CN) /V(H2O)=1：1进行测试。 实验部分 三、pH对RA荧光光谱的影响 结果表明,探针RA在较宽的pH范围内(4.1~10.5)主要以螺环形式存在,其水溶液既无颜色又几乎无荧光,表明它是一个对pH不敏感的荧光分子探针,经拟合计算得pKa=3.00. 本论文选用CH3CN/H2O(体积比1:1)体系进行试验。 实验部分 四、离子选择性 在5Lmol/L RA的乙腈/水(体积比1：1)溶液中分别加入50Lmol/L不同种类的常见金属离子,室温下反应2 h.被测试的金属离子有Na+, K+, Mg2+,Ca2+, Mn2+, Cd2+, Cr3+, Co2+, Ni2+, Ag+, Pb2+, Zn2+, Fe3+, Hg2+和Cu2。 除了Hg2+有很小的荧光响应外,其它常见的共存金属离子未表现出荧光增强性能。 因此, RA是一个高选择性荧光增强型Cu2+探针。 实验部分 在6.5×10-8~2.9×10-6mol/L范围内，Cu2+的浓度与相对荧光强度(△F=F-F0）呈良好的线性关系，线性回归方程为△ F=3.43c-0.07(c的单位是10-6mol/L),相关系数R2=0. 9989.测定11次探针空白,得标准偏差为5.72×10-8,以3倍标准偏差计算得到检出限为5. 0×10-8mol/L。 铜离子含量的测定 ① ② ③ ④ 其荧光发射波长在可见区，用在细胞中可避免细胞自身荧光和背景散射的影响。 激