辅助生殖PGD与PGS技术课件.ppt

辅助生殖PGD与PGS技术;内容概要;一、植入前遗传学诊断与筛查的概念;第三代试管婴儿？;PGD的意义;PGD发展历程;染色体异常（罗氏易位、相互易位、倒位等） 染色体异常的筛查 单基因病（一般的单基因病、性连锁遗传病等） 单基因异常的筛查 ; ;二、PGD检测流程;极体活检;卵裂球活检;囊胚活检;染色体易位(Translocation):一种染色体结构异常，一条染色体的一段转移到同一条或另一条染色体上，导致易位片段基因的重排 (ThompsonThompson GENETICS IN MEDICINE 2010) 易位是一种常见的染色体结构重排异常，新生儿中发病率0.2%.(Stern et al., 1999) 临床上两种类型的易位最常见：罗氏易位和相互易位 ;4q25;罗氏易位： 这种类型的易位是在两组端着丝粒染色体 (D组 and G 组, 染色体13-15, 21-22)间进行交换，往往在靠近着丝粒的区域断裂重组，导致易位的两条染色体随体的丢失 --ThompsonThompson GENETICS IN MEDICINE 2010;易位携带者的健康风险;平衡易位携带者的遗传风险;;染色体易位和生殖健康;PGD用于易位携带者治疗的历史;荧光原位杂交(FISH);荧光原位杂交(FISH-PGD);欧洲生殖与胚胎学协会(ESHRE) ---FISH-PGD实践指南;ESHRE要求： 实验室胚胎活检技术； 遗传室细胞核玻片固定基础，并对固定程序有详细要求； 选择合适的探针，对平衡易位患者需提前做好外周血淋巴细胞中期分裂相预实验；;细胞核玻片固定程序： 活检卵裂球(1枚或2枚)或囊胚滋养层细胞(TE)； 低渗液滴中处理≥5min； 在圆圈标记对应的玻片正面部位加固定剂(Tween-20/HC1)，将低渗好的细胞转至固定剂液滴中； 待固定剂完全干燥后，可放在-20℃备用，或者直接进入下一步； 60℃烤片，30min-3h；RNase消化，蜡膜封片，湿盒中37度孵育30min-1h； 将RNase处理后的玻片依次过2xSSC、75%、90%、100%酒精，梯度脱水； 将玻片放入变性液中，75℃预变性3-5min（目的是将DNA双链打开）； 玻片依次过75%、90%、100%酒精梯度脱水，2min/浓度，完全风干； 探针75℃变性5min； 将探针加到风干的玻片样本上，双层蜡膜封片，置于湿盒中，37℃过夜（杂交4-6h）； 玻片依次过洗涤液WS1三缸(45℃)，WS2两缸（室温），WS3一缸（室温）； 75%、90%、100%酒精梯度脱水，风干； 加入DAPI，处理3min后，直接荧光显微镜下观察。;平衡易位探针选择和淋巴细胞预实验 探针的选择：商业探针的使用需通过QC质控；自制探针也需要进行合适的QC/QA鉴定。 所有探针在应用到临床检测前都需经过细胞杂交预实验，评估特异性、亮度及弥散度； 对于所有平衡易位携带者，需要取用对应易位区段合适的探针以及探针组合对夫妻双方淋巴细胞中期分裂相及间期核进行预实验检测： 至少分析20个中期分裂相，确保探针位置在正确的染色体上，易位片段能被正确指示； 至少分析100个间期核，评估特异性、亮度及弥散度。;一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。;一例相互易位携带者PGD，核型为： 46,XY,t(6;10)(q13; p15)，活检2枚胚胎，对单卵裂球进行FISH检测，发现1枚信号正常，移植1枚，妊娠单胎，产前诊断为正常核型，已出生正常婴儿。;;;单卵裂球FISH几种风险可能导致没有准确结果：;胚胎序号;FISH面临的挑战;不同实验室FISH检出率和准确率波动较大;FISH技术局限;二、基于全染色体筛查的PGD(PGD-CCS);易位携带者的SNP-PGD临床情况总结;;共分析360 个患者年龄在20~44岁之间，平均新发生异常的几率是27.2% ;;新一代测序技术(NGS)正逐步兴起;NGS-PGD/PGS技术路线;方法学的建立;NGS vs SNParray 在非整倍体与16M缺失重复的比较;技术特点;我们前期已建立了FISH、SNP芯片技术检测染色体异常，并与华大合作建立了单细胞水平的全基因组测序。 2012年8月诞生了世界首例由NGS-PGD助孕的健康女婴。 ;三、单基因病PGD;ESHRE PGD工作组对扩增基础的PGD的最佳实践指南 ;单基因病PGD的流程;1、等位基因脱扣（allele dropout, ADO