免疫组化和特殊染色课件.ppt

免疫组化和特殊染色;第一节 免疫组织化学 技术概述;（一）发展简史 ;2000年以后各种免疫组化技术更加成熟,使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。其应用范围深达医学各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。;定义:是应用免疫学基本原理—抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。 将试剂抗原或试剂抗体用可以微量检测的标记物进行标记，在与标本中的相应抗体或抗原反应后，可以不必测定抗原抗体复合物本身，而测定复合物中的标记物，通过标记物的放大作用，进一步提高了免疫技术的敏感性。;抗原是指能够刺激机体产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应（特异性反应）的物质。抗原的基本特性有两种，一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是抗原性 ;病原微生物 在医疗中将病原微生物制成疫苗进行预防接种，可以提高人的免疫力。 嗜异性抗原 一类与种属特异性无关的、存在于人以及某些动物、植物、微生物的性质相同的抗原。 肿瘤抗原 由物理的、化学的因素或某些病毒诱发的实验动物肿瘤，其细胞中或细胞表面均出现特异性抗原，称为肿瘤特异性抗原。已证实在某些人类肿瘤中心存在着与病毒密切相关的抗原。 同种异体抗原 动物免疫血清 ;抗体（antibody）指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。 ;世界著名抗体公司 ; 它借助于荧光素、酶等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关抗原相结合，由于荧光素所发荧光可用荧光显微镜检出，而酶可经一定的显色处理，呈现醒目的阳性色彩，从而可准确定位欲测定的抗原物质。 ;荧光素、酶;;? 三大系统 本技术是应用免疫学原理来识别待测抗原，再通过酶和底物的作用外加显色剂，将上述反应显示出来。;免疫组 织化学;识别系统是指特异性抗体识别组织或细胞中的靶抗原。抗原抗体的特异性结合是本技术的基本依据。;联结系统由联结抗体构成。它的作用是联接识别系统和显示系统。 ;显示系统的目的是使抗原抗体间的特异性结合变为肉眼可见。因此显示系统由标记酶，底物和显色剂组成，以在靶抗原存在位点上形成有色沉淀。 ;;IHC方法;3 最新一代的免疫组化 Novolink Polymer法：使用小分子聚合物（减少细胞薄膜硬脂的阻碍，比传统中的大分子聚合物染色更显著），信号放大更强，还可以检测到组织中低浓度的抗原。 ; EnliVision法的工作程序： 切片，烤片，脱蜡水化（使用防脱片处理的玻片：多聚赖氨酸，APES） H2O2处理（—阻断内源性过氧化物酶），蒸馏水漂洗 组织切片的预处理（枸橼酸钠缓冲液中热修复，酶消化—暴露出抗原决定簇），TBS漂洗 内源性过氧化物酶的阻断 一抗孵育，TBS漂洗 二抗孵育，TBS漂洗 DAB显色，蒸馏水中止反应 苏木素复染及封片;切片;IHC染色结果的判读原则;玻片干燥造成的“边缘效应”;酒精固定;假 阴 性;II. 染色的特异性判定;;;;Fujita Health University School of Medicine;细胞膜阳性;细胞核阳性;细胞核酶：如 TdT 类固醇激素受体：如 ER、PR、AR 细胞核钙结合蛋白：如 S100蛋白、calretinin 定位细胞核的病毒：如 CMV、HBcAg（核+核周） NeuN：neuronal nuclei，表达于成熟的神经元;细胞浆内颗粒状阳性--定位于细胞器;细胞浆纤维状阳性--中间丝或微丝;弥漫或片状的细胞浆阳性; ① 分化差恶性肿瘤的诊断和鉴别诊断； ② 证实内分泌肿瘤和神经内分泌肿瘤； ③ 应用肿瘤胚胎性抗原诊断某些肿瘤，如癌胚抗原（CEA）对胃肠道癌、甲胎蛋白（AFP）对肝癌和卵巢内胚窦癌诊断有帮助； ;④ 有时可帮助确定肿瘤的良恶性，如应用免疫球蛋白轻链κ和λ来鉴别滤泡性恶性淋巴瘤和滤泡性反应性增生； ⑤ 研究某些癌症与病毒的关系，如肝癌与乙型肝炎病毒、鼻咽癌与EB病毒、宫颈癌与乳头状瘤病毒等的关系；;⑥ 为肿瘤治疗的选择提供依据，如乳腺癌检测雌、孕激素受体（ER、PR）呈阳性时，应用他莫昔芬（三苯氧胺）治疗可预期获得较好的疗效； ⑦ 检测癌基因和抑癌基因蛋白产物（如c-erbB2，p53）、增生活性抗原（如Ki-6