蛋白质 分离纯化主要方法.ppt

应用 分离纯化酶、 抗原、抗体 分离纯化核酸 研究酶的结构与功能 基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、 sepharose、sephadex 聚焦层析（Chromatofocusing） 该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。 原理 pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。 1、pH梯度的形成 2、蛋白质行为 3、聚焦效应 层析时的聚焦效应示意图 pH梯度溶液的形成示意图 蛋白质1（pI=7） 蛋白质2（pI=8） 流速 移动速率 几种主要层析方法比较 二 、 电泳技术 电泳的一般原理 电泳技术的分类 电泳的影响因素 常用电泳技术 电泳的一般原理 电泳是带电颗粒在电场作用下向着与其电荷相反的电极移动的现象 。许多生物分子都带有电荷，其电荷的多少取决于分子组成、性质及其所在介质的pH。如果混合物中各组分的结构组成不同，在某一pH溶液中，各组分所带电荷性质、电荷数量不同，加之其分子量不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异，而达到分离鉴定各组分的目的。 电泳分类 （一）按原理分四种 1.区带电泳：是当前应用最为广泛的电泳技术。2.自由界面电泳： 这是瑞典Uppsala大学的著名科学家Tiselius最早建立的电泳技术，是在Ｕ形管中进行电泳，无支持介质，因而分离效果差，现已被其他电泳技术所取代。3.等速电泳：需使用专用电泳仪，当电泳达到平衡后，各电泳区带相随，分成清晰的界面，并以等速向前运动。4.等电聚焦电泳：由两性电解质在电场中自动形成pH梯度，当被分离的生物大分子移动到各自等电点的pH处聚集成很窄的区带。 （二）按支持介质的不同可分为：　　1.纸电泳　　2.醋酸纤维薄膜电泳 　　 3.琼脂凝胶电泳 　　 4.聚丙烯酰胺凝胶电泳　　5.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）。 （三）按支持介质形状不同　　 1.薄层电泳 ； ? 2.板电泳 ；? ? 3.柱电泳。 （四）按用途不同可分为：1.分析电泳； 2.制备电泳；? 3.定量免疫电泳； （五）按所用电压不同可分为：　1.低压电泳：100V～500V，电泳时间较长，适于分离蛋白质等生物大分子。　2.高压电泳：1000V～5000V，电泳时间短，有时只需几分钟，多用于氨基酸、多肽、核苷酸和糖类等小分子物质的分离。 （六）按pH的连续性不同可分为： 1.连续pH电泳：如纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳； 2.非连续pH电泳：如聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳； 电泳技术分类（按实验装置分类） 纸电泳 薄膜电泳 凝胶电泳 毛细管电泳 毛细管电泳 三、影响电泳的因素 （一）带电颗粒的物理性状 （二）支持物介质： （三）缓冲溶液(pH 离子强度) （四）电场强度： （五）电渗现象： （六）焦耳热对电泳的影响 四、常用电泳技术 1、醋酸纤维薄膜电泳 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） 3、SDS、PAGE等电点聚焦 3、琼脂糖电泳 4、毛细管电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ? 凝胶聚合反应及催化系统 ? 不连续PAGE ? 可产生的三种效应： 电荷效应、 分子筛 效应、 浓缩效应 聚丙烯酰胺凝胶电泳（Polyacrylamide gel electrophoresis　PAGE ），是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺（CH2=CHCONH2 Acrylamide）和甲叉双丙烯酰胺（CH2(NHCOHC=CH2) 2 N,N’-methylenebisacrylamide）聚合而成，这一聚