PCR技术原理与操作上课讲义.pptVIP

PCR技术原理与操作;主要内容;3、微生物分类（按核酸类型）;（2）RNA微生物;二 DNA复制原理;1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。 但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了…… ;Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法…...;Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ……;;四 PCR基本原理;;;;;;;;;1、PCR体系组分;（1）模板 模板作为DNA合成时的初始链，可以是DNA或cDNA分子，模板需要量一般为102～105拷贝。 （2）扩增缓冲液 缓冲液有助于酶的稳定，是给聚合酶提供一个最适合酶催化反应条件。10～50mmol/L Tris-Hcl(pH8.3～8.8） （3）耐热DNA聚合酶 催化PCR反应，该酶是从Thermus aquaticus细菌中提取的特殊的耐热DNA聚合酶，可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本；具有 5′→3′方向的聚合活性和外切活性。;美国 Yellowstone 公园的热泉;（4）4种dNTP混合物 四种脱氧核苷酸，是DNA的原料； dNTP的通常使用浓度为20～200μmol/L。 （5）引物 作为合成起始的识别点，从引物末端开始延伸，合成整条链。通常使用浓度为0.1-0.5 ?mol/L （6）Mg2+ Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。 Mg2+与dNTP以及DNA模板结合形成复合体，只有这种复合体才能被DNA聚合酶识别；通常使用浓度为 0.5mmol/L-2.5mmol/L。;六 PCR操作步骤与结果分析;1、RNA/DNA提取;（1）Trizol提取RNA法：;（1）Trizol提取RNA法：;(1)Trizol提取RNA法：;注意事项;(2)DNA提取;(2)DNA提取;全自动提取核酸,实现自动化,提高了RNA提取效率和纯度，适合高通量检测（32份样品，时间35min）。;(3)RNA的反转录;(4)PCR扩增;取TAE缓冲液50倍稀释后用于配制1.5％的琼脂糖凝胶及作电泳缓冲液用。取10μL PCR产物，混于2μL 6×上样缓冲液液中，电泳分析PCR产物。以DNA分子量Marker为片段长度大小参考。;PCR反应结果电泳示例;七 PCR技术优点和缺点;;PCR检测技术在PRRSV诊断中的应用;谢谢大家！