DNA重组技术与基因操作 (2).pptVIP

DNA重组技术与基因操作 (2);基因工程研究的理论依据;DNA重组技术要有四个必要条件：; DNA限制性内切酶可分为三类： Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ Ⅰ、Ⅲ酶在基因工程中基本不用,why?;Ⅰ、Ⅲ限制性内切酶在同一蛋白分子中兼有甲基化作用及依赖于ATP的限制性内切酶活性。 Ⅰ类酶结合于特定的识别位点，但却没有特定的切割位点，酶对其识别位点进行随机切割，很难形成稳定的、特异性切割末端。 Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA，然后从底物上解离下来。 ;核酸内切限制酶的类型及其主要特性;一、II类限制性内切酶的特点;EcoRI特异识别GAATTC及其互补碱基组成的双链片段 ;二、使用限制性内切酶时应注意的问题;2、注意酶反应条件，相同反应条件的酶可以同时酶解DNA样品。 3、注意说明书中所列出的comments的内容，会提供有关限制性内切酶识别序列中位点特异性甲基化的信息以及引起酶产生star activity的原因。;4、注意酶的浓度，酶切时不是酶加得越多越好。 一般以在20μl反应体积中，37℃，每小时水解1微克DNA的酶量定为一个酶单位。 5、注意酶在保温过程中的活性变化。 ACCⅠ在5 小时内具有全部活力 BamHⅠ在第一个小时内具有全部活力，在第二小时具有部分活力，而在2小时以后就无活力了。 CfoⅠ仅在第一个小时内具有全部活力，一个小时以后就没有活力了。;三、连接酶 定义：用于将两端乃至数段DNA片段拼接起来的酶。 用途： （1）、连接带匹配粘末端的DNA分子； （2）、使平末端的双链DNA分子相互连接或与合成的寡核苷酸接头相连接。 →这类反应要比粘末端之间连接慢得多，但单价阳离子（150-200mmol/LNacl）或低浓度的聚乙二醇（PEG）可提高连接效率。;DNA连接酶;;3、T4噬菌体多核苷酸激酶： 催化ATP的γ－磷酸基转移至DNA或RNA片段的5’末端。 用途：标记DNA片段的5’端?，制备杂交探针；基因化学合成中，寡核苷酸片段5’－磷酸化；用于测序引物的5’标记。 ;4、碱性磷酸酶： 用途： 去除DNA片段5’末端的磷酸，以防止在重组中自身环化，从而提高重组效率； 在用［γ－32p］ATP标记DNA或RNA的5’末端前，去除DNA或RNA片段的非标记的5’磷酸。 ;;第二节克隆载体;大肠杆菌表达载体应具备： 强的启动子，一个强的可诱导的启动子可使外源基因有效的转录； 在启动子下游区和ATG（起始密码子）上游区有一个好的核糖体结合位点序列（SD）； 在外源基因插入序列的下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因的有效转录和质粒的稳定性。;一、质粒(plasmid);质粒载体的基本要求;F质粒：有些携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息的质粒。 R质粒：表达对一种抗生素的抗性的质粒。 降解质粒：携带参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因的质粒。 穿梭载体：在大肠杆菌的载体上放上第二个复制起始位点，使它在另一个宿主细胞中也能进行复制。 ;1、质粒载体pBR322 特点 1）大小为4363bp； 2）含有两个抗生素基因（抗氨苄青霉素和抗四环素）； 3）有单一的BamHⅠ、HindⅢ和SalⅠ的识别位点（在四环素抗性基因内）、PstⅠ识别位点（在氨苄青霉素抗性基因内）； 外源片段在BamHⅠ、 HindⅢ、 PstⅠ位点插入时，可引起抗生素失活来筛选重组体。 4）带有一个复制起始点，可以保证这个质粒只在大肠杆菌里行使复制功能，在大肠杆菌里pBR322以高拷贝数存在。;;2、质粒载体pUC19 1）特征 大小为2686bp；乳糖操纵子β－半乳糖苷酶 带有pBR322的复制起始位点，一个氨苄青霉素抗性基因； 一个大肠杆菌乳糖操纵子β－半乳糖苷酶基因的调节片段（lacZ’）,一个调节lacZ’基因表达的阻遏蛋白的基因lacI； 含有多个单克隆位点。;;;2）pUC19的筛选： 培养基中含有异丙基硫代半乳糖苷（IPTG，lac操纵子的一个诱导物）时，lacI的产物就不能与lacZ’的启动子区域结合，质粒pUC19的lacZ’就可以转录，进而翻译，lacZ蛋白会与染色体DNA编码的一个蛋白形成具有活性的杂合β－半乳糖苷酶； 在底物5－溴－4氯－3吲哚－β－半乳糖苷酶（X-gal）存在下，X-gal会被杂合β－半乳糖苷酶水解成蓝色的产物，没有插入外源DNA序列的pUC19质粒克隆就呈蓝色； 由于pUC19的单克隆位点的序列是整合在lacZ’之中的，若pUC19质粒中插入有目的DNA片段，就会破环lacZ’的结构，导致细胞无法产生功能性的lacZ蛋白，也就无法形成杂合的β－半乳糖苷酶，因而菌落是白色的。;;α－互补原理;穿梭质粒:人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质