蛋白浓度的测定.pptVIP

* * 蛋白浓度的测定 实验目的 通过实验使学生掌握蛋白质浓度测定的三种方法的原理、实验步骤 了解改良lowry法、Coomassie亮蓝法、紫外分光光度法测定蛋白浓度的区别、优缺点以及适用范围。 实验原理 改良Lowry法 在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反应 ） 蛋白质分子中带有酚基的酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成钼蓝-钨蓝蓝色化合物，蓝色深浅与蛋白质含量成正比。利用蓝色深浅与蛋白质浓度成正比的关系可绘制标准曲线，测定样品中蛋白质含量。（还原反应） 改良lowry法的原理图 650nm Coomassie亮蓝法 Coomassie亮蓝G250能与蛋白质的疏水区域结合，这种结合具有高度敏感性，G250与蛋白质形成的复合物成蓝色，在595nm处有最大吸收峰，颜色深浅与蛋白质浓度成正比关系，通过建立标准曲线可测定未知蛋白浓度。 紫外分光光度法 有些蛋白质组成中常含有酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸，在紫外光280nm处有最大吸收峰，故可根据280nm处的吸光度的大小来测定这类蛋白质的含量。 在生物样品中还可能会含有核酸等成分，在280nm处也有吸收，它的最大吸收峰在260nm可通过经验公式排除核酸的影响 蛋白质浓度＝1.45A280－0.74A260 波长 260 280 实验步骤 改良Lowry法 编 号 1 2 3 4 5 6 测定管 蛋白含量 ug/ml 17.5 35 70 105 140 0 未知 标准溶液、样品 ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 - 1.0 生理盐水 ml - - - - - 1.0 - 试剂A ml 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 混匀后置于50度水浴中保温10分钟，冷却 室温放置10分钟 立即混匀，置于50度水浴中保温10分钟，冷却后在650nm处比色 试剂B ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 试剂C ml 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 改良Lowry法蛋白质浓度测定 制备标准曲线，根据测定管的OD650nm值计算未知蛋白质浓度 Coomassie亮蓝法 管 号 1 2 3 4 5 6 测定管 蛋白质含量ug/ml 500 250 125 62.5 31.25 0 未知 标准溶液 ml 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 － － 生理盐水 ml － － － － － 0.1 － 样品 ml － － － － － － 0.1 染液 ml 5 5 5 5 5 5 5 *