组织化学技术应用酶的组化.pptVIP

第二章 酶组织化学 酶组织化学（Enzyme Histochemistry）是利用组织细胞内酶具有催化某种反应的特性来检测酶活性。一般是用冻结或固定的切片，再一定条件下（具有酶的底物等）全酶进行催化作用，产生一种可见产物，沉淀在酶所在的部位，最终通过显微镜对酶的活性进行定位或定量研究。 ※ 特点： ① 在原位检测 ② 检测酶的活性而不是酶分子本身 酶的分类：按生物化学分类——六大类 ① 氧化还原酶 ② 转移酶 ③水解酶 ④ 裂解酶 ⑤异构酶 ⑥连接酶 常用检测方法 1．沉淀法 ①金属沉淀法：Ca++—Co++法；Pb法 ②偶联法：重氮盐法 ③ 靛原法 ④四唑盐法 2．后偶联法Post-coupling（ACP） 3．合成法 4．底物膜法 设计半透膜 切片/ 孵育法 ★★★ 影响酶组化实验的关键因素 ① 酶活性的保存 a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不 同的酶适用不同的固定剂 △ 抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金 属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。 △慎用醛 b）取材：快捷，实验准备充分。冰结切片应先备液氮防止酶活性丧失。横冷箱切片稍固定（丙酮∶氯仿=1∶1）4℃，5～10分钟，但脂溶性蛋白脱落。 ② 底物浓度 A）量要足够1∶20 V/ V B）孵育法只能用一次，配制 时要适量（节俭） ③ PH和渗透压 应以缓冲液调节 ④ 温度控制与时间：室温37℃（40min） 4℃（5～10min） ⑤ 捕获剂 亦要求一定浓度，要以反应原位瞬 时沉淀。 ⑥ 激活剂与抑制剂（对照） a）两者的选择都应具有特异性。 b）要有适当的浓度范围 ⑦ 时间：通过实验自行摸索。任何配方都是一 个很大的范围（指时间），受多种因 素的影响，因药品的质量、环境因素 的变化而变化。故不可轻信之。 ⑧ 扩散：控制反应速度，避免扩散（冰冻 切片孵育尤应注意） ⑨ 对照：必须设立对照，以防非特异反应。 这对结果的解释非常重要。 ★★★ 对结果的分析，应考虑如下几个问题： ①　经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟 能保留多少？ ②　酶是否在原位？ ③　反应中多少酶起了作用？ ④　酶的活性是否代表细胞生活时的活性？ ⑤　沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延 长，会不会改变？ ⑥　是否有扩散移位 一、钙—钴法显示碱性磷酸酶  Alkaline Phosphatase （ALP） 〔原理〕以天然存在的β—甘油磷酸钠为底物，经酶水解释放出磷酸，立即被钙离子沉淀为 磷酸钙，再依次被置换为磷酸钴和硫化钴，最终产物为黑色的硫化钴沉淀。反应式如下： 〔方法〕 标本：大白鼠肾、小肠恒冷温箱切片（载片） 厚6微米。 固定：丙酮∶氯仿（1∶1）混合液。4℃ 2~5′ ①切片标本入下列孵育液中，37℃，5分钟 孵育液： 3％β—甘油磷酸钠 6ml 底物 保 2％巴比妥钠 6ml 调PH 证 2％氯化钙（无水） 9ml 沉淀剂 新 2％硫酸镁 6ml 激活剂 鲜 蒸馏水 3ml 30ml 将孵育液混匀，若浑浊可过滤，调PH至9.4。 ② 流水流水洗2分钟后→入蒸馏水