生化实验-酵母RNA的提取及组分鉴定说课材料.pptVIP

生命科学学院 生物化学实验 主讲：刘连芬聊城生命科学学院E-Mail：liulianfen@lcu.edu.cn 酵母RNA的提取及组分鉴定 生 物 化 学 实 验 生命科学学院 生物化学实验 一、实 验 原 理 二、主要实验仪器 三、实 验 步 骤 四、实 验 小 结 酵母RNA的提取及组分鉴定 一、相关知识背景 生命科学学院 实验原理 生物化学实验 Exit 酵母RNA的提取及组分鉴定 工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法提取的RNA都是变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单,成本较低。浓盐法是用高浓度的盐处理，同时加热，以改变细胞壁的通透性，使核酸从细胞内释放出来。如用10％左右的NaCI溶液90ml提取3---4小时，迅速冷却，提取液离心后，上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法是用稀碱溶液使细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后 ,的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。 生命科学学院 实验原理 ⑵定磷试剂鉴定：上述反应当有还原剂存在时，MO6+被还原成MO4+，此4价钼再与试剂中的其他MO42-结合成MO（MOO4）2或MO3O8,呈蓝色，称为钼蓝。在一定浓度范围内，蓝色的深浅和磷含量成正比，可用比色法测定RNA的含量。 生物化学实验 Exit 酵母RNA的提取及组分鉴定 酵母含RNA,2.62---10％,DNA含量仅为0.03-0.516%，所以提取RNA多以酵母为原料。 RNA用硫酸水解时，可以生成磷酸、戊糖和碱基. ⑴ 强酸使RNA分子中的有机磷消化成无机磷，使与钼酸铵试剂中的钼酸铵结合成磷钼酸铵[(NH4）3PO4·12MoO3】。（黄色沉淀） PO43-+3NH4++12MOO42-+24H+=(NH4)3PO4·12MOO3·6H2O↓+6H2O（黄色）。 生命科学学院 实验原理 ⑵ 核糖：RNA与浓盐酸共热时，发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与地衣酚反应，在Fe3+或Cu2+催化下生成鲜绿色复合物。脱氧核糖与二苯胺试剂反应成蓝色化合物，而核糖无此反应。 地衣酚鉴定戊糖时特异性较差，凡属戊糖均有此反应。微量DNA无影响，较多DNA存在时有干扰作用，在试剂中加入适量CuCl2· 2H2O可减少DNA的干扰，甚至某些戊糖持续加热后生成的羟甲基糠醛也能与地衣酚反应，产生显色复合物。 生物化学实验 Exit 酵母RNA的提取及组分鉴定 ⑶ 嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤银化合物沉淀。 生命科学学院 实验步骤 酵母RNA的提取及组分鉴定 生物化学实验 生命科学学院 实验步骤 生物化学实验 酵母RNA的提取及组分鉴定 一、RNA的提取 1.7g酵母悬浮于0.2％氢氧化钠溶液70ml中。 2.将悬浮液转移至150ml锥形瓶中，在沸水浴上加热30分钟，冷却至室温，离心（4000r/min）15分钟。 生命科学学院 生物化学实验 Exit 酵母RNA的提取及组分鉴定 3.将上清液缓缓倾入30ml乙醇溶液中，注意要一边搅拌一边缓缓倾入。加毕用冰醋酸调pH至2.5，静置，等核糖核酸沉淀完全后，离心（4000r/min）3min。 生命科学学院 实验步骤 生物化学实验 酵母RNA的提取及组分鉴定 4. 用95％乙醇30ml，移入布氏漏斗中，再用乙醇冲洗离心管，一起移入布氏漏斗，抽滤。洗涤沉淀共两次；无水乙醚洗涤沉淀两次，每次20ml，布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。 生命科学学院 二.水解RNA 生物化学实验 Exit 酵母RNA的提取及组分鉴定 取提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10ml，在沸水浴中加热10min制成水解液并进行组分的鉴定。 生命科学学院 三、RNA组分鉴定 生物化学实验 Exit 酵母RNA的提取及组分鉴定 1.嘌呤碱：取一支试管，加入水解液1ml ，浓氨水2ml ，5％的硝酸银溶液1ml，观察有无白色嘌呤碱基的银化物沉淀产生（见光变为红棕色），解释原因。 生命科学学院 生物化学实验 酵母RNA的提取及组分鉴定 2.戊糖：取一支试管，加入水解液1ml ，加入三氯化铁的浓盐酸溶液2ml和苔黑酚的乙醇溶液3滴，在沸水浴中加热，观察试管内颜色变化。解释原因。 生命科学学院 生物化学实验 Exit 酵母RNA的提取及组分鉴定 3.磷酸：取两支试管，各加入1ml水解液，在一只试管中加入定磷试剂1ml，在另一支试管中加入钼酸铵试剂1ml在沸水浴中加热，观察溶液颜色变化。解释原因。 生命科学学院 主要实验仪器 生物化学实验 抽 滤 系 统 离 心 机 恒温水浴