显微切割技术.pptVIP

显微切割技术 第四军医大学 病理与病理生理学教研室 闫庆国 组织成分的异质性（多样性）与研究需要的同质性（单一性）的矛盾如何解决？ 如何分离研究中需要的越来越小的单一的细胞内组分？ 解决之道 显微切割技术是解决的方法之一。 第一部分：显微切割技术概况 概念 特点 方式 材料 范围 结合技术 影响因素 应用领域 第二部分： 激光捕获显微切割技术 第一部分显微切割技术概况 I .显微切割的概念 显微切割（microdissection)技术是在显微状态下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。 II. 显微切割技术的特点 同质 可以保证所取材料一定层次上的同质性 ； 结合 可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。 III. 显微切割方式 镜下手工操作 机械微调辅助 液压显微操纵 激光捕获系统 镜下手工操作特点：精度低，范围大，易开展。 机械微调辅助特点：精度有提高，二维操作，简单易行低耗。 IV.显微切割材料 石蜡切片 冰冻切片 细胞爬片 细胞涂片 细胞铺片 染色体片 V.显微切割范围 组织切割 细胞群切割 单个细胞切割 单细胞内组分切割 染色体区带切割 VI.显微切割结合技术 免疫组织化学 原位杂交 FISH Southern,Northern,Western Blots PCR 基因克隆 VII.显微切割用于PCR分析所需细胞数的影响因素 切片厚度 细胞大小 固定方式 DNA提取方式 PCR扩增片段长度 单个细胞用于突变分析所需要的最小细胞数： 冰冻切片同流式细胞仪 10个 石蜡切片 30个 VIII.显微切割应用领域 肿瘤基因突变检测 肿瘤异质性研究 新基因的发现 染色体畸变分析 细胞局部病变病因研究 微阵列（microarray）分析 特异基因表达分析 杂和性丢失检测 微卫星序列不稳定性分析 核酸及蛋白质的定量研究 第二部分 激光捕获显微切割技术 Laser Capture Microdissection Two general classes of laser-capture microdissection Infrared (IR) capture system Ultraviolet (UV) cutting system Uncover Hidden Molecular Signatures from Pure Cell Populations? 小 结 显微切割是一项精细的取材技术 在选用异质性的材料进行研究时都可考虑用此技术提升研究的科学性 50,000–100,000 cells 3.7 mm2 area 10,000 cells (100–200 ??g in 350 ??20,000–25,000 cells 50,000 cells 2D gel electrophoresis Protein 500 cells (optimized blotting procedure) 2,500 cells 8,000–10,000 cells Western blot Protein 100 cells/1 reaction or 2,000 cells/200 ??l 4,000–5,000 cells QRT-PCR RNA 100 cells from FFPE Gene-expression arrays RNA 25,000 cells (93 ng total RNA) 5,000 cells (14.7–18.6 ng total RNA) cDNA library construction RNA 2,000 cells Genetic mosaic analysis gDNA 200 cells Imprinting/DNA methylation DNA 100–1,000 cells