Ⅰ型糖尿病相关抗原C望hgA的HAL-A0201限制性表位的合成与鉴定.docxVIP

目 目 录 I型糖尿病相关抗原ChgA的甩A．A*0201限制性表位的合成与鉴定一1一 中文摘要 一1_ 英文摘要 -5- 前刖 言舌 。l．1 00． 材料与方法 ．一14一 结纠了7K 果 一二u一一26一 讨 论 ．一47一 结 论 ．一55- 参考文献 ．一56一 致 谢 ．-61一 基于胰岛素的I型糖尿病抗原治疗研究进展 ．．62— 万方数据 I型糖尿病相关抗原ChgA的HLA．A*0201限制性表位的絮 I型糖尿病相关抗原ChgA的HLA．A*0201限制性表位的 絮木中文摘要 、．㈣．Y碧80㈣9539u薹539 目的：I型糖尿病(Typel diabetes，T1D)是一种胰岛B细胞被自身 反应性CD4+和CD8+Y细胞介导破坏后，胰岛素分泌绝对不足而造成的自 身免疫性疾病。现已公认，在非肥胖性糖尿病(nonobese diabetic，NOD) 小鼠和I型糖尿病患者中，自身反应性CD4+T细胞和CD8+细胞毒性T 细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)均是发病中不可缺少的效应细胞。 对胰岛B细胞的自身免疫攻击进行抗原特异性的免疫干预与阻断，可以 重新建立机体对胰岛B细胞自身抗原的免疫耐受，是一种可能从根本上 预防T1D发生和发展的理想途径，故寻找T1D发病过程中重要的靶标抗 原以诱导免疫耐受具有重要意义。大多数胰岛13细胞自身抗原都可以被 CD4+T细胞和CD8+T细胞识别，如胰岛素(insulin)、谷氨酸脱羧酶 (glutamic acid decarboxylase，GAD)和胰岛特定的葡萄糖一6．磷酸酶催化 亚基相关蛋白(islet—specific glucose一6一phosphatase catalytic subunit—related protein，IGRP)。嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A，ChgA)是近几年刚被 发现的T1D相关抗原，它可以被NOD小鼠和人类的CD4+T细胞识别，但 能否被CD8+T细胞所识别还未知。皿A—A。0201是亚洲及高加索人群中的 高频等位基因(HLA．A2超型占有比例为50 040)，研究发现该基因与T1D 高患病风险有一定相关性。国外David VS研究小组建立了一个 皿A—A*0201转基因NOD小鼠模型——-NOD．B2m肌“HHD小鼠，并证实了 +本课题由国家自然科学基金项目(NoNo资助 万方数据 该人源化NOD小鼠模型能被用于HLA．A*0201限制性的T1D优势CD8+T 该人源化NOD小鼠模型能被用于HLA．A*0201限制性的T1D优势CD8+T 细胞表位的鉴定，从而解决了实验研究中胰腺组织样本极少且很难获取， 外周血中自身反应性CD8+T细胞数量极少的问题，使关于T1D患者 HLA．A*0201限制性CD8+T细胞表位鉴定的研究得到了极大的发展。本 研究预测并初步合成了皿A．A*0201限制性T1D相关抗原ChgA的CD8+T 细胞表位肽，对继续深入研究眦A．A2超型表位有较大的参考价值，对T1D 基于超型表位的耐受诱导治疗提供新的候选靶标抗原表位具有一定价值。 方法：使用SYFPEITHI、IEDB和NETMHC三个表位预测网站进行预测， 对预测结果进行综合分析，得到与肌A．A*0201限制性候选表位肽，再应 用间接荧光标记法检测候选表位肽与甩A．A*0201的相对亲和力。再进行 体外细胞功能试验，通过Elispot Assay检测候选表位肽诱导小鼠脾淋巴细 胞IFN．Y表达的能力，使用[3H]thymidine掺入法检测表位肽诱导脾淋巴细 胞增殖的能力，利用以上两个实验对候选表位肽进行初筛；再通过胞内因 子染色流式细胞术分析表位肽特异性CD8+CTL表达IFN．Y、IL．17的水平 判断其诱导细胞因子的能力，同上方法检测其诱导表达perforin的水平以 判断细胞毒作用的大小，并利用mA—A2抗体阻断T2抗原提呈，以判定 IFN—Y、IL一17和perforin由CD8+CTL表达。结果：1．通过分析归纳 SYFEPITHI、IEDB和NETMHC三个在线表位预测网站的结果，预测得到 HLA—A*0201限制性的四条候选表位肽ChgA 9、ChgA43-52、ChgA8-16和 ChgA75．84。合成后通过HPLC检测纯度大于95％，通过质谱检测分子量与 理论值吻合。2．通过间接免疫荧光法检测四条抗原表位肽与甩A．A*0201 分子的相对亲和力，得到各抗原表位肽的相对荧光强度FI。ChgA】0_。9和 万方数据 ChgA43．52的相对荧光强度分别为2．74±0．37、3．56±0．41，高于 ChgA43．52的相对荧光强度分别为2．