动物组织核酸的分离鉴定和含量测定.pptVIP

动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定 1. 猪肝基因组DNA分离 2. 核酸的定量和纯度测定 3. 脱氧核糖的显色实验 DNA和RNA的结构 1. 猪肝基因组DNA的分离 核酸分离的原则 在溶解细胞的基础上，利用有机溶剂抽提蛋白质（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀核酸，收获 核酸分离的一般步骤 盐溶法分离DNA和RNA的原理 根据RNA与DNA在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离： 在0.14M的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1M的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。 然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离DNA和RNA的目的。 酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提 酚：有效的使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH7.8，以防止DNA分配到有机相。 氯仿：强烈的脂溶性，去除脂类杂质，增加有机相比重。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水，可以用氯仿将水相中的酚去除。 异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。 实验步骤 2. 核酸的定量和纯度测定 紫外分光光度法: 定量： 260nm下，1OD相当于50ug/ml双螺旋DNA， 40ug/ml 双链RNA 检测纯度：纯的DNA A260/A280=1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。 定糖法: DNA糖部分为脱氧核糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法 定磷法: 测定核酸的磷酸部分 实验方法 1ml SC溶液溶解DNA， 8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml离心管中，用1ml 0.01M NaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解，并再次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用 A260测定：以SC溶液作为空白，取上清测A260值（OD3.0即在测量范围之内），并计算DNA浓度（1OD=50mg/ml DNA） A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小于1.8 若A260/A280比值较为正常，则可确定二苯胺法测量DNA浓度的粗略稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA浓度约为100ug/ml） 3. 脱氧核糖的显色实验 加热条件下： RNA＋浓盐酸＋地衣酚 绿色 DNA＋酸＋二苯胺 　蓝紫色 二苯胺显色法原理 DNA标准曲线的制作和样品测定 DNA含量计算 根据标准曲线,以样品的光密度计算出相应DNA含量,并同紫外法测定的值进行比较，分析二者差异的原因。 注：二苯胺试剂具有腐蚀性，且二苯胺反应产生的蓝 色不易褪色，操作中应防止洒出，比色时，比色杯外面一定要擦干净。 实验报告要求 实验结果以研究论文形式提交电子版本 包括摘要、前言、实验材料和实验方法、实验结果和分析、讨论和参考文献 * 在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。 尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 SDS可破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离，EDTA则抑制细胞中Dnase的 活性；而蛋白酶K可将 蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。 因为本次实验要求纯度不高，所以未用酚抽提蛋白质，而仅仅用氯仿来去除脂类和少量蛋白 如果A260/280过高，则二苯胺法测量的稀释倍数应相应减小 核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式--核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用 核酸分为两大类--核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物 核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含