人组织型纤溶酶原激活剂t-PAELISA试剂盒.docVIP

人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)ELISA试剂盒 本试剂盒仅供研究使用。 检测范围： 96T 0pg/ml-160pg/ml 使用目的： 本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)水平。用纯化的人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，再与HRP标记的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)浓度。 试剂盒组成 1 30倍浓缩洗涤液 20ml×1瓶 7 终止液 6ml×1瓶 2 酶标试剂 6ml×1瓶 8 标准品（160pg/ml） 0.5ml×1瓶 3 酶标包被板 12孔×8条 9 标准品稀释液 1.5ml×1瓶 4 样品稀释液 6ml×1瓶 10 说明书 1份 5 显色剂A液 6ml×1瓶 11 封板膜 2张 6 显色剂B液 6ml×1/瓶 12 密封袋 1个 标本要求 1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融 2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。 3. 血清： 室温血液自然凝固10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 4. 血浆： 应根据标本的要求选择EDTA、柠檬酸钠或肝素作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5. 尿液： 用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照此实行。 6. 细胞培养上清： 检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。 7. 培养细胞 检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 8. 组织标本 切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），或组织蛋白萃取试剂, 用手工或匀浆器将标本匀浆化。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 自备材料 1．? 蒸馏水。 2．? 加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200、500ul、1000ul。 3．? 振荡器及磁力搅拌器等 操作步骤 标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 80pg/ml 5号标准品 150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液 4opg/ml 4号标准品 150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液 20pg/ml 3号标准品 150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液 10pg/ml 2号标准品 150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液 5pg/ml 1号标准品 150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液 加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。 配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。 温育：操作同3。 洗涤：操作同5。 显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.