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细胞培养操作及其注意事项 易红飞一 、准备工作 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。 2. 从冰箱拿出试剂（培养基，胰蛋白酶，PBS等），放在室温条件下，或37℃水浴。水浴箱中水应常换，从水浴箱中拿出东西要擦干，喷酒精。 3. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如移液器和枪头盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以酒精擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 4. 操作人员应注意自身的安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。用酒精擦拭手套后才可进行操作。 5. 实验服应该定期灭菌和更换。进出细胞间时，不要同时打开相邻两个房间的门。 二、贴壁细胞的换液及传代 1. 换液 当培养基中有较多漂浮的死细胞或者培养基颜色变黄，而细胞密度未达到60%左右时，可只考虑换液而暂时不进行传代。 吸弃原培养液或直接倒弃，加入新的培养液。 注意：对于一些贴壁不牢固的细胞株（如Hela 细胞），加入新培养液时应把枪头贴于器皿壁上缓慢注加，或需要避免更换枪头时，可考虑滴加于器皿壁上，以免把已贴壁的细胞吹起。） 2. 传代 当细胞密度达到70%-80%时，需要进行传代。 ?吸弃或者倒弃原培养液。 ?加入适量PBS以漂洗除去残余的原培养液。 ?加入适量的胰蛋白酶，混匀后放置培养箱37℃孵育1-3分钟。 ?观察细胞消化情况。 ?加入完全培养基以终止消化。 ?按比例把细胞传到新的培养皿中。→放置细胞培养箱中培养。 注意： ?判断细胞是否要传代的准则是不能让细胞生长密度大于80%。 ?血清中有抑制胰蛋白酶的成分。加入的胰蛋白酶的量不能太多，只要稍微能覆盖细胞层面即可。若加入的胰蛋白酶较多，会伤害细胞且有可能反而降低消化效率。 孵育时间不能过长，否者对细胞照成伤害。一般来说1-3分钟足够，尽量不要超过5分钟。 贴壁较牢固的细胞株（如4T1细胞株），需要孵育时间较长，而贴壁不牢固的细胞株（如Hela 细胞株），需要孵育时间较短。一般来说，细胞生长密度较大时，需要孵育时间较长。 ?不需要专门离心以去除胰蛋白酶，加入完全培养基即可。若需要去除胰蛋白酶，可离心弃上清以除去胰蛋白酶。 ?根据细胞生长速度的不同选择不同的传代比例。 ?尽量不要使用原培养皿，因为经胰蛋白酶处理后的培养皿表面涂层会发生变化，会在一定程度上影响细胞的性状。 三、细胞计数及存活率检测 计数池两侧各有一支持柱，将特制的专用盖玻片覆盖其上，形成高0.10mm的计数池。计数池划有长、宽各3.0mm的方格，分为9个大格，每个大格面积1.0mm2。容积为0.1mm3，其中，中央大方格用双线双成25个中方格，位于正中及四角5个中方格是红细胞计数区域，用单划线分为16个中方格。 当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数大方格的上方和右方线上的细胞。 计算公式 细胞数（4个角大方格区域内的细胞数之和/4)×104×稀释倍数×细胞悬液总体积 细胞计数板用后要清洗，切勿用硬物洗刷。 细胞存活率检测 原理：采用台盼蓝据染法区分死活细胞，正常健康细胞能够排斥台盼蓝，而丧失细胞膜完整性的细胞可以被台盼蓝染色研制而成。严格来说，台盼蓝检测的是细胞膜的完整性，通常认为细胞膜丧失完整性，即可认为细胞已经死亡。 商品化的0.4%台盼蓝染液，或自行配制（台盼蓝用生理盐水溶解） 直接向欲计数的细胞悬液中加入等体积的台盼蓝染液，轻轻混匀，染色3分钟，不宜超过10分钟。然后计数。 细胞存活率=（细胞总数-蓝色细胞数）/细胞总数×100% 四、细胞冻存 1. 冷冻前检测细胞是否保有其特有性质。 2. DMSO应为试剂级等级，无菌且无色。小体积分装，4℃避光保存，勿做多次解冻。10%浓度配制冻存液。 3. 由于DMSO稀释时会放出大量热量，故不可将DMSO直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。 4. adherent tumor lines: 5-7 x 106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma 解冻后须较高之浓度，而HeLa 只需1-3 x 106 cells/ml。other suspensions: 5-10 x 106 cells/ml, human lymphocyte 须至少5 x 106cells/ml。 5. 回收动物细胞，其离心速率一般为300×g(约1,000rpm），过高的转速，将照成细胞死亡。 五、细胞复苏 1. 37℃解冻时，注意水面不可超过冷冻管沿，否者易发生污染情况。冷冻管由液氮中取出解冻时，必须注意安全，预防冷冻管爆裂。 2. 除少数特别注明对DSMO敏感的细胞