第3章--生产菌种的选育-2018-10-10.pptVIP

五. 菌种保藏和复壮 （1） 斜面保藏法：试管置于4℃冰箱保藏；需每隔1-3个月重新转接一次，菌种易衰退 （2） 液体石蜡保藏法：液体石蜡液面以高出培养基最上端1cm左右为宜，置4℃冰箱中保存。保存期约 一年左右； （3） 沙土管保藏法：土：河沙 = 1:3；保藏时间可达数年，甚至数十年； （4） 真空冷冻干燥保藏法：真空冷冻干燥保藏是在低温、干燥和缺氧的件下保藏菌种与保护剂混合， 置入特制安培管，- 40℃低温冷冻干燥速，可保藏数十年； （5） 液氮超低温保藏法：液氮罐超低温保藏法是将菌悬液，与保护剂混合，密封于安瓿管中，经程序 降温冻结后， -196 -150℃液氮中保藏。菌悬液可用终浓度为10％甘油或5％二甲基亚砜作为保护剂； （6） 低温保藏法：普通冷冻保藏技术是在密封管中加入1ml菌液，封口，-20℃，可保藏约1-2年。如果同 时加入20%甘油溶液作为冷冻保护剂则效果较好。 （7）超低温冷冻保藏技术(-80℃)与液氮法类似，加入等体积的20％甘油或10％二甲亚 砜作保护剂，混匀、装管。保藏。 将已衰退的菌种性能回复到原有形状的过程-----复壮。 六. 基因工程与代谢工程育种 第一代基因工程技术：30年前兴起的用于基因克隆和表达的DNA重组技术，使我们有了产率大幅提高的工业生产菌株，或抗虫的基因工程农作物品种等； 第二代基因工程技术：20年前发展起来的在分子水平上对蛋白质的结构和功能进行局部修饰和改造的蛋白质工程技术，使我们能合成具有特殊功能的蛋白质； 第三代基因工程技术：10年前发展迅速并得到广泛应用的对生物细胞内固有的代谢途径进行改造或设计的代谢工程技术，使人类能以代谢工程菌株为生物转化器获得价格更低廉的生产机器。 目标：操纵细胞的初级代谢或次生代谢途径以获得有价值的产物： (1)合成异源代谢产物； (2)扩大底物利用范围； (3)生产非天然的新物质； (4)降解环境有害复合物质； (5)提高对环境的适应能力； (6)阻断或降低副产物的合成； (7)提高代谢产物产率等。 特点：针对的是整个代谢网络而不是单个的生化反应，同时强调现代生物平台技术的整合与集成。 概念：Metabolic engineering：利用DNA重组技术或分子生物学方法，对细胞代谢途径进行有目的、功利性修饰或改造，提高目的产物产率、拓展底物利用或产生新的目的产物。 Part 1:Bacterial cellulose synthesis mechanism of facultative anaerobic bacteria Enterobacter cloacae FY-07 Genome sequencing results analysis From outside to inside: Genome size (each scale represent 0.5Mb) CDS of the sense strand (different colors represent different COG） CDS of the anti-sense strand(different colors represent different COG) tRNA and Rrna GC content GC skew values(G-C/G+C) 步骤一：工业菌株遗传背景的获得 疑问 Part 1:Bacterial cellulose synthesis mechanism of facultative anaerobic bacteria Enterobacter cloacae FY-07 Results Genome sequencing results analysis （1）增加限速步骤酶编码基因的拷贝数、强化表达水平或阻断相关代谢旁路，提高细胞原有代谢途径中某类产物的代谢流； （2）利用基因修饰扩展酶系对底物的识别和催化范围，经细胞原有代谢途径合成新的化合物; （3）导入异源基因或基因簇，利用细胞原有代谢途径构建新的代谢旁路，合成新型产物。 步骤二：操纵微生物代谢途径获得有价值的产物 （一）改变代谢流 1、加速速度限制反应 去乙酰氧基头孢菌素C产生菌种：顶头孢酶（Cephalosporium acremonium） 去乙酰氧基头孢菌素C的生物合成： 前体： 氨基己二酸 ＋ 半胱氨酸 ＋ 缬氨酸 ↓