分子生物学08DNA操作.pptVIP

Chpt 5. DNA 操作的原理与方法 Principle and basic process of gene cloning Enzymes Vectors Gene library Gene transformation The simple gene cloning 二、基因工程工具酶和DNA加工 基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加工、连接等。 DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。 二、基因工程工具酶和DNA加工 基因工程的关键技术包括DNA的合成、切割、修饰加工、连接等。 DNA在连接之前必须进行加工，把DNA分子切割成所需的片段。有时为了便于DNA片段之间的连接，还须对片段末端进行修饰。一般把DNA分子切割、DNA片段末端修饰和DNA片段连接等所用的酶称为工具酶。 二、基因工程工具酶和DNA加工 1. DNA切割 1.1 限制性内切酶 (restriction endonuclease) 类型：即I 、II / III 型酶。真正有用的是II 型酶。 命名：属命＋种名＋菌株＋顺序号 Hind III；EcoRI；BamHI。 至今已发现上千种限制性内切酶，常用的有几十种。 特异性：4－6 碱基的识别位点 HpaII：C’CGG EcoRI：G’AATTC BamHI： G’GATCC Aha III：TTT’AAA 二、基因工程工具酶和DNA加工 1. DNA切割 1.2 DNase DNase I 无识别的内切酶，可产生大小均一的片段。 1.3 物理方法 利用超声波；振荡、加压等。 二、基因工程工具酶和DNA加工 2. DNA的修饰 Phosphatase 去除DNA末端的5’ P，防止分子间的连接。 Polymerase 补平DNA双链；合成DNA和RNA分子。 Exonucleases 补平DNA双链 Methylase 保护内切酶位点的降解 二、基因工程工具酶和DNA加工 3. DNA的连接 类型 平端连接与粘端连接。 酶 T4 DNA ligase：平端连接与粘端连接 E. coli DNA ligase：粘端连接 三、简单的基因克隆策略 三、简单的基因克隆策略 四、基因文库 基因组文库：Genomic library 包含所有基因组DNA片段重组子的总和。多用于基因结构研究。 cDNA文库：cDNA library (Expression library) 包含所有cDNA分子的重组子的总和。多用于基因表达产物，即基因功能的研究。 四、基因文库 基因组文库的构建： 基因组DNA的提取 基因组DNA的消解(随机) 补 平 插入载体(连接) 扩增 四、基因文库 2. cDNA文库的构建： 总mRNA的提取 反转录 cDNA合成 插入l噬菌体载体(连接) 转化进入细菌 扩增 四、基因文库 基因组文库的筛选 基因组文库培养 DNA探针或 蛋白抗体探针筛选 挑单斑 测序鉴定 五、PCR原理与方法 PCR引物设计 六、常用载体的种类与结构 质粒载体 Plasmid ori： 复制起点 Ampr、Tetr：抗性筛选基因 适宜的克隆位点 适当的拷贝数 六、常用载体的种类与结构 质粒载体 Plasmid 六、常用载体的种类与结构 质粒载体 Plasmid 六、常用载体的种类与结构