大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞——何久香.pptVIP

威斯腾生物技术中心 大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养及腺病毒感染细胞 （一）大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养 （二）腺病毒感染细胞 （一）大鼠脊髓星形胶质细胞的原代培养 1、实验前期准备 2、脊髓星形胶质细胞的分离 3、脊髓星形胶质细胞的培养 实验前期准备： 实验器械的高压灭菌 新生鼠的购买 培养瓶的包被 （细胞培养前1-2 h，培养瓶用0.1％多聚赖氨酸包被，置5％C02培养箱中，使用前用DMEM/F12培养基冲洗干净，吸尽所有多余的DMEM/F12培养基后备用于种板） 脊髓星形胶质细胞的分离 1、取新生乳鼠6只，75％乙醇皮肤消毒。无菌条件下剪刀断头，打开脊椎后取出脊髓组织并置于盛有DMEM/F12培养基的培养皿中反复冲洗，尽可能洗掉可能附着的表面血细胞。 2、使用眼科镊细致的剥离皮层表面蛛网膜，并取出脊髓，在该过程中可适当撕开软脊膜组织一并去掉脊髓组织深面的血管，随后使用冰预冷DMEM/F12反复冲洗。 3．在玻璃培养皿中用眼科剪将脊髓组织剪碎致直径0.3 mm左右小块，在剪碎过程中避免挤压脊髓组织，加入无菌3 ml 0.25％胰酶，置37℃细胞培养箱中消化30 min至浑浊状。 4．加入2-3 ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，静置3 min后先用吸管吸去多余液体，再用吸管轻轻地吹打3次，收集细胞悬液，经200目的不锈钢网滤过除去杂质，过滤后的细胞悬液移入10 ml无菌离心管中，然后800 rpm离心7 min。 5．弃去上清液，然后每管加入2-3 ml含10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于培养瓶中，37℃、5％CO2培养箱内孵育60 min，进行差速粘附贴壁处理，以去除成纤维细胞。 6．轻轻翻转培养瓶，吸出细胞悬液，种于预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶；继续在CO2培养箱内培养，接种2-3 d后更换新的无菌培养基，隔2-3 d换新培养液1次。生长8-10 d待细胞融和后，置于37℃恒温摇床机中，180 rpm，14-16 h。 7．丢弃上清液，收集经过摇床震荡后的贴壁细胞，加新鲜培养液继续培养，即可得纯度较高的星形胶质细胞。 脊髓星形胶质细胞的培养 细胞换液 对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2~3次，补加入新培养基后继续培养或实验。 细胞传代 对于贴壁细胞，首先应先吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2~3次，50ml培养瓶加入胰酶消化液约1ml，晃动使消化液铺均匀，置37度培养箱约2-5分钟，镜下见细胞收缩变圆或少数脱落后，轻轻振动瓶底使细胞全部脱落，加入2-3ml完全培养基后，轻轻吹打，收集细胞至离心管，1000转/min离心5min，弃上清，加培养液，轻轻吹打成细胞悬液，按照1：2或1：3的比例传代至无菌培养瓶内，加入培养基后继续培养或实验。 （二）腺病毒感染细胞 确定腺病毒的最佳感染滴度 腺病毒感染细胞 确定腺病毒的最佳病毒滴度（96孔板） 准备细胞：8000～10000个细胞 /孔接种于96孔板 病毒稀释：在离心管中用维持液将病毒液作连续10倍的稀 释，从10-1到10-7 病毒感染：将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100ul；设正常细胞对照(两纵排),只加维持液100ul。 细胞培养：将培养板放置于CO2培养箱（37℃5%CO2）， 培养5-7天 测定结果：取出培养板，显微镜下观察细胞病变 ，并用Reed-Muench法 计算病毒的最佳滴度 腺病毒感染细胞 准备细胞 准备病毒 感染细胞 做实验，找威斯腾