聚丙烯酰胺凝胶电泳.PPTVIP

思考题 1、提取的环状质粒DNA在琼脂糖凝胶电泳中可出现几条带？ 2、电泳中缓冲液的作用是什么？ 核酸电泳技术 教学目的 掌握琼脂糖凝胶电泳分离DNA的基本原理和技术流程。 常用电泳 1、琼脂糖凝胶电泳：一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳：可用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。其分辨率较高。 琼脂糖和聚丙烯酰胺是目前实验室最常用的支持介质 琼脂糖核酸凝胶电泳是分子克隆核心技术之一，用于分离、鉴定和纯化DNA或RNA片段 优点：1.对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 2.凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸、病毒 等大分子物质。 3.透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 4.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 5.有热可逆性 琼脂糖凝胶的特点 缺点：1.琼脂糖支持层上的区带易于扩散，电泳后必须立即固定染色。 2.与PAGE相比，分子筛作用小，区带少。 琼脂糖的基本结构是由 1,3 连结的 β-D- 半乳糖和 1,4 连结的 3,6- 脱水 α-L- 半乳糖相间联结而成。琼脂糖在水中一般加热到 90℃ 以上溶解，温度下降到 35 -40℃ 液体形成良好的半固体状的凝胶。琼脂糖的凝胶性是由存在的氢键所致，凡是能破坏氢键的因素都能导致凝胶性的破坏。 1,3 连结 1,４ 连结 1,４ 连结 3,6- 脱水 3,6- 脱水 核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团，呈负离子化状态；核酸分子在一定的电场强度的电场中，它们会向正电极方向迁移，其迁移速率又受到多方面因素的影响。 琼脂糖凝胶电泳工作原理 + - Power DNA? - + 电镜下观察其显微结构(1×1?μm) ? 制备好的琼脂糖凝胶是多孔的，可以使DNA通过 电压、缓冲液、琼脂糖浓度、DNA片段的大小、DNA构象等均会决定DNA的迁移速率 小片段DNA比大片段DNA在其他条件相同下泳动速率要快 琼脂糖浓度越低，相同核酸分子迁移越快 同一分子：超螺旋环状＞线状＞切口环状 DNA迁移速率的决定因素 + - Power small large 线形DNA分子，其电场中的迁移率与其相对分子质量的对数值成反比 不同类型琼脂糖的性质 琼脂糖类型 凝结温度/℃ 熔化温度/ ℃ 备注 标准琼脂糖 35~38 90~95 不同厂家生产的不同商品其凝结温度和熔化温度有一定差异 40~42 85~90 高强度琼脂糖 34~43 85~95 修饰的低熔点/ 凝点琼脂糖 25~35 63~65 35 65 超低熔点 8~15 40~45 低黏性低熔点琼脂糖 25~30 70 38 85 30 75 不同类型琼脂糖分离DNA片段的范围 浓 度（%） 标 准 (kb) 高强度(kb) 低熔点(kb) 低黏度低溶点(kb) 0.3 1~50 0.5 0.7~25 0.8 0.5~15 0.8~10 0.8~10 1.0 0.25~12 0.4~8 0.4~8 1.2 0.15~6 0.3~7 0.3~7 1.5 0.08~4 0.2~4 0.2~4 2.0 0.1~3 0.1~3 3.0 0.05~1 0.5~1 4.0 0.1~0.5 6.0 0.01~0.1 琼脂糖? 缓冲液? 三角烧瓶? 琼脂糖凝胶的配制 琼脂糖的称量 欲配制100ml 1% 浓度的琼脂糖凝胶，称取1g琼脂糖粉，倒入指定三角瓶中，加入100ml 1×TBE 琼脂糖凝胶电泳的设备 电泳槽? 电源? ?电泳槽盖子 琼脂糖凝胶容器? 梳子? 如右图将梳子佳好，注意观察梳子的底部应不与容器接触，以免做出的胶漏孔。 煮胶 琼脂糖在常温下是不融的 煮化后呈透明状 *** 在微波炉中煮化时要小心不要让凝胶暴沸，要间歇性煮。 待三角瓶冷却到60 ℃左右时倒胶，赶走气泡 保证每个梳子齿均能插入胶5mm左右即可 待胶凝固后，小心拔去梳子，拔出时注意不要破坏胶孔. 用刀片切下所需的胶块，放入加有足够电泳缓冲液(1×TBE)的电泳槽中，缓冲液面高于凝胶表面3～5mm即可 倒胶 上样 电泳 操作方法： 可在一干净手套上点滴适量(1～3uL)的3×溴酚兰上样缓冲液(深绿色)，用枪移取适量的样品(1～10uL)与滴加好的溴酚兰上样缓冲液混合(可观察到混合液变为蓝色)，再将混合液小心加入胶上的